小滴度，大問題：病毒滴度是否越高越好？
重組腺相關(guān)病毒（recombinant Adeno-associated Virus, rAAV）基因治療在靶器官（包括眼睛、肝臟、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)）的多項(xiàng)試驗(yàn)中已經(jīng)證明了安全性和長期有效性。在臨床前和臨床研究中，rAAV基因組拷貝數(shù)的精確滴定對(duì)于確保準(zhǔn)確、和可重復(fù)給藥至關(guān)重要。同樣，在科學(xué)研究中，rAAV的基因組拷貝數(shù)精確滴定對(duì)于獲得有效的、穩(wěn)定的、可靠的、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有著不可或缺的作用。rAAV的基因組拷貝精確滴定即為滴度，通常是通過測量衣殼蛋白或rAAV基因組來確定的。
關(guān)于你不知道的滴度
滴度一般包括物理滴度和感染滴度。
物理滴度是指：包含病毒基因組的病毒顆粒的濃度。物理滴度是通過定量病毒基因組濃度來測量的。物理滴度不一定能表明感染滴度，rAAV的感染滴度可以根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶點(diǎn)而變化，也可以通過病毒溶液的凍融來改變（Lock et al., 2010）。qPCR是目前廣泛應(yīng)用于rAAV載體定量分析的方法之一。
感染滴度是指：可以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的病毒顆粒的濃度。感染滴度通常通過細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)測定來定量。有研究顯示，rAAV物理滴度與感染滴度的比約為50:1（Zeltner et al., 2010）。
PFU、TU、VG、GC都叫滴度，傻傻分不清？
重組病毒的滴度有很多種單位表示形式，比如PFU/mL，TU/mL，VG/mL，GC/mL等，這些差異主要是由于不同病毒特性來約定俗成的，實(shí)際應(yīng)用中如何區(qū)分這些不同滴度單位?
PFU/mL：是空斑形成單位，為Plaque Forming Unit per mL的縮寫，多用于腺病毒、單純皰疹病毒等容易引起細(xì)胞裂解的病毒載體的滴度標(biāo)定。
TU/mL：是活性滴度單位，為Transduction Units per mL的縮寫，主要是指可以感染并進(jìn)入細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)量，常用于慢病毒的滴度測定。
因此，九游會(huì)j9需要在課題研究過程中關(guān)注所用病毒載體的類型和滴度特性來綜合判斷。
是不是rAAV的劑量越高，效果就越好？
在一些研究中，針對(duì)rAAV衣殼或轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的免疫反應(yīng)已被確定為導(dǎo)致表達(dá)減少或完全喪失的原因。低劑量的rAAV有可能被anti-AAV抗體，甚至低滴度的中和抗體中和，從而導(dǎo)致效果不明顯，然而，過高劑量的rAAV，隨著衣殼劑量的增加，使得對(duì)衣殼特異性T細(xì)胞活化，激活免疫介導(dǎo)從而清除轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞，導(dǎo)致治療效果喪失，甚至由于嚴(yán)重的免疫反應(yīng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)對(duì)象的損失（Mingozzi et al., 2013）。
因此rAAV的滴度及使用劑量應(yīng)盡量保持在一定范圍內(nèi)，并不是越高越好，以保證使用的最佳效果。
圖1 載體劑量與系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染后效果之間的關(guān)系
（Mingozzi et al., 2013）
如何精確rAAV滴度？
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參考文獻(xiàn)
[1] Lock, Martin, et al. Characterization of a recombinant adeno-associated virus type 2 Reference Standard Material. Human gene therapy 21.10 (2010): 1273-1285. PubMed PMID: 20486768. PubMed Central PMCID: PMC2957240.
[2] Zeltner, Nadja, et al. Near-perfect infectivity of wild-type AAV as benchmark for infectivity of recombinant AAV vectors. Gene therapy 17.7 (2010): 872-879. PubMed PMID: 20336156. PubMed Central PMCID: PMC2900506.
[3] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013 Jul 4;122(1):23-36. doi: 10.1182/blood-2013-01-306647. Epub 2013 Apr 17. PMID: 23596044; PMCID: PMC3701904.
[4] Lang JF, Toulmin SA, et al. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 2019 Jul 30;10(1):3415. doi: 10.1038/s41467-019-11321-7. PMID: 31363095; PMCID: PMC6667494.
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