供稿人：舒易來團(tuán)隊

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）官網(wǎng)報道，超過全球人口的5%，即4.66億人患有致殘性聽力障礙，其中3400萬是兒童。盡管研究發(fā)現(xiàn)超過120個基因與非綜合征型或綜合征型耳聾相關(guān)（http://hereditary hearing loss.org/），但臨床上對于遺傳性感音神經(jīng)性聾的治療除了佩戴助聽器和植入人工耳蝸等，尚無任何有效的藥物治療手段。在非綜合征型遺傳性耳聾中，常染色體隱性遺傳性耳聾占80% (Korver et al., 2017)。

對于隱性遺傳性耳聾，最佳的治療方法是對基因突變位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)地修復(fù)，進(jìn)而長久地恢復(fù)聽力。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是近年來興起的新型基因編輯工具，已在疾病的治療中表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。該系統(tǒng)主要由sgRNA和Cas9兩部分組成，二者形成復(fù)合體， sgRNA與靶位點(diǎn)反向互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)定位后，同時識別PAM序列，Cas9核酸酶切割DNA，導(dǎo)致DNA發(fā)生斷裂。細(xì)胞內(nèi)主要有兩種DNA損傷修復(fù)機(jī)制，非同源末端連接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復(fù)（Homologous recombination，HR）。當(dāng)有外源性DNA模板存在時，利用HR可以實(shí)現(xiàn)序列的任意精確變換或者定點(diǎn)插入，但其效率不高，尤其在非分裂細(xì)胞中，HR的效率更低，這極大限制了HR在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

研究團(tuán)隊在先前的研究中通過在同源模板兩側(cè)引入sgRNA的靶位點(diǎn)，開發(fā)了一種以同源臂介導(dǎo)的末端接合（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）為基礎(chǔ)的基因敲入策略 (Yao et al., 2017)，在體內(nèi)、體外均實(shí)現(xiàn)了高效而精確的整合（圖1）。HMEJ介導(dǎo)的基因敲入方法為包括基因編輯動物模型的建立和遺傳性疾病的精準(zhǔn)靶向基因治療等提供了廣闊的前景。目前，尚無基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HR策略進(jìn)行耳聾基因治療的體內(nèi)研究。

圖1 設(shè)計HMEJ同源重組治療方案。a 針對篩選的sgRNA，設(shè)計HMEJ同源臂。b 基于AAV作為體內(nèi)遞送載體的雙AAV治療體系，其中一個AAV遞送用于表達(dá)Cas9的載體，另外一個遞送表達(dá)sgRNA以及攜帶同源臂的載體。

Klhl18^lowf小鼠模型

Klhl18^lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F發(fā)生錯義點(diǎn)突變（Chr9:110455454 C>A），其純合子小鼠表現(xiàn)為第4周開始出現(xiàn)以低頻為主的漸進(jìn)性聽力下降，隨著年齡增長，聽力下降逐漸累及其它頻率，最后發(fā)展為全頻型嚴(yán)重耳聾，而雜合子小鼠聽力正常，表現(xiàn)為隱性遺傳。Klhl18^lowf隱性遺傳性耳聾小鼠模型在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞纖毛的形態(tài)異常 (Ingham et al., 2021)。

CRISPR/Cas9-HMEJ體系

該研究首先針對基因Klhl18^lowf突變位點(diǎn)設(shè)計、篩選和構(gòu)建了HMEJ治療體系。在新生小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行體外sgRNA篩。⑾謘gRNA2的效率較高。將表達(dá)Cas9的質(zhì)粒與攜帶HMEJ同源模板和表達(dá)sgRNA2的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至帶有Klhl18^lowf突變的成纖維細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)明顯得到了的糾正，且sgRNA2不產(chǎn)生明顯的脫靶編輯。

基于CRISPR/Cas9-HMEJ體系體內(nèi)驗(yàn)證
體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)設(shè)計的HMEJ系統(tǒng)可以精確糾正Klhl18^lowf點(diǎn)突變后，該研究進(jìn)一步在體內(nèi)探索該系統(tǒng)的療效。用雙AAV包裝CRISPR/Cas9-HMEJ基因修復(fù)體系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，將其在Klhl18^lowf新生鼠出生后1天（P1）顯微注射至小鼠的內(nèi)耳。在小鼠P14和10周齡時，體內(nèi)編輯效率檢測結(jié)果表明，雙AAV治療系統(tǒng)在體成功糾正了Klhl18基因C>A點(diǎn)突變，隨著編輯時間的延長，10周齡的修復(fù)效率提高了約3倍，而在未注射耳中，沒有觀察到明顯的堿基插入、缺失或突變堿基的糾正。通過掃描電鏡技術(shù)，與野生型小鼠相比，發(fā)現(xiàn)8周齡的未治療純合突變小鼠的內(nèi)毛細(xì)胞最高一排靜纖毛表現(xiàn)為更長、更細(xì)且頂端成尖細(xì)的錐形，而治療后的小鼠有部分內(nèi)毛細(xì)胞的靜纖毛恢復(fù)正常的形態(tài)，表現(xiàn)為最高一排靜纖毛大部分呈柱形且更短。在治療后小鼠耳蝸的頂圈和中圈，平均約16%的內(nèi)毛細(xì)胞具有正常或接近正常的纖毛束形態(tài)。聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response, ABR）測試結(jié)果顯示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系后8周，注射耳的ABR閾值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明顯下降，且治療效果持續(xù)至小鼠24周齡（實(shí)驗(yàn)觀察期）。電生理檢測結(jié)果顯示，在較長時間（200 ms）的去極化脈沖刺激條件下，未注射耳的內(nèi)毛細(xì)胞膜電容與野生型相比明顯下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系能將注射耳內(nèi)毛細(xì)胞膜電容恢復(fù)至野生型水平，即治療體系修復(fù)了內(nèi)毛細(xì)胞持續(xù)囊泡釋放功能。

綜上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可對體內(nèi)內(nèi)耳毛細(xì)胞中的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的糾正，恢復(fù)了耳蝸部分內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛形態(tài)、修復(fù)了內(nèi)毛細(xì)胞持續(xù)囊泡釋放功能并持久改善了Klhl18^lowf隱性遺傳性耳聾小鼠的聽覺功能，為最終在人類隱性遺傳性耳聾及其它器官系統(tǒng)隱性遺傳性疾病中實(shí)現(xiàn)安全、持久的基因治療提供了科學(xué)依據(jù)和參考。

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來研究員、李華偉教授和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院（深圳）農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員為共同通訊作者，顧晰博士后、胡新德博士后（中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所）和王大奇博士后為共同第一作者。