時間：2022-01-26 熱度：

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和學習誘導(dǎo)的神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)都受到基因表達的時空調(diào)控。組蛋白重構(gòu)在生理和病理條件下調(diào)控這類基因的表達起著重要作用，因此，組蛋白重構(gòu)可能成為許多重大腦疾病的潛在藥物靶點。

 

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶被確認為許多神經(jīng)發(fā)育障礙的風險基因。Ash1l是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，屬于三胸家族（trxG）蛋白的成員之一，其能拮抗多梳蛋白家族對基因轉(zhuǎn)錄的抑制功能。目前越來越多的研究證明，Ash1l基因功能缺失是自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder, ASD）發(fā)生的首要危險因素，然而，關(guān)于Ash1l單倍體不足導(dǎo)致與 ASD相關(guān)致病機制尚不清楚。

2022年1月26日，上？萍即笱蒲в爰際躚г管吉松教授團隊利用Ash1l缺失小鼠模型、行為學范式、光遺傳學等多個技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠ASD樣行為，破壞活動依賴的突觸修剪過程，并對該現(xiàn)象進行了系統(tǒng)性探索，相關(guān)研究成果刊發(fā)在神經(jīng)科學頂級期刊Neuron上，標題為ASH1L haploinsufficiency results in autistic-like phenotypes in mice and links Eph receptor gene to autism spectrum disorder

 

 

結(jié)果

 

 

前腦神經(jīng)元Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠的ASD樣表型

 

首先，作者比較了Ash1l^+/-小鼠[1,2]和WT小鼠的行為學表型，在Ash1l^+/-小鼠中檢測到了單倍體不足，同時，曠場實驗（the open-field test）和埋珠實驗（the marble-burying test）行為學范式結(jié)果顯示，Ash1l^+/-小鼠表現(xiàn)類似焦慮、重復(fù)刻板的行為（圖1A,B）。此外，對出生后7-9天（P7-P9）小鼠進行幼鼠超聲發(fā)聲測試，發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-小鼠在生命早期存在現(xiàn)溝通障礙的現(xiàn)象（圖1C）。三箱社交實驗（three-chamber assay）結(jié)果顯示Ash1l^+/-小鼠也表現(xiàn)出社交障礙（圖1D）。這些結(jié)果提示了Ash1l突變小鼠表現(xiàn)出典型的自閉癥樣行為，包括溝通困難，重復(fù)刻板行為、社交障礙等。

 

單細胞基因表達分析發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中， Ash1l優(yōu)先在神經(jīng)元中表達（圖1E）。因此，研究人員借助原位雜交鏈式反應(yīng)（HCR-FISH）做進一步驗證，發(fā)現(xiàn)在皮層神經(jīng)元中，Ash1l陽性信號與Map2陽性信號（(Map2⁺，神經(jīng)元標志物）高度重疊（圖1F）；在Map2^-細胞中，Ash1l信號點數(shù)量明顯減少。這提示了神經(jīng)元中Ash1l功能缺失可能導(dǎo)致自閉癥譜系障礙 (Autism Spectrum Disorder, ASD）樣行為。

 

基于上述結(jié)果，作者構(gòu)建Ash1l^Emx1-cKO小鼠（特異性在前腦，特別是新皮層和海馬區(qū)敲除Ash1l,圖1G-I），并通過行為學范式發(fā)現(xiàn)，前腦Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠ASD樣行為（圖1J-L）。
 

圖1 Ash1l單倍體不足導(dǎo)致小鼠的ASD樣表型

 

 

Ash1l突變小鼠存在辨別能力缺陷

 

接下來，研究人員對Ash1l缺失小鼠的學習行為進行評估，借助條件性恐懼反射范式發(fā)現(xiàn)，Ash1l^+/-小鼠和WT小鼠均學會了情境性恐懼條件反射，并表現(xiàn)出類似的恐懼記憶重提水平，然而Ash1l^+/-小鼠在恐懼學習的第三天表現(xiàn)出木僵行為（freezing, 老鼠的一種防御反應(yīng)）下降；此外，在Ash1l^+/-小鼠中未觀察到兩種不同環(huán)境下的木僵行為差異（WT小鼠在context A中表現(xiàn)出較高的木僵行為，在context B（新環(huán)境）中表現(xiàn)出較低的木僵行為），提示了Ash1l^+/-小鼠辨別能力受損（圖2A,B）。

 

在音調(diào)依賴的辨別范式（圖2C-E）和基于音調(diào)的Go-No-go行為范式（圖2F-H）中，Ash1l^+/-小鼠同樣表現(xiàn)出明顯的聽覺辨別障礙（聽覺腦干反應(yīng)（ABR）測試Ash1l^+/-小鼠無明顯的聽力損失）。

 

為了驗證前腦神經(jīng)元中Ash1l缺失是否會導(dǎo)致與Ash1l^+/-小鼠類似的辨別能力障礙現(xiàn)象，作者借助Ash1l^Emx1-cKO小鼠進行相關(guān)行為學范式，發(fā)現(xiàn)Ash1l^Emx1-cKO小鼠與恐懼記憶相關(guān)的聽覺辨別能力明顯受損（圖2J,K）。這種Ash1l突變小鼠的辨別能力異常符合部分ASD患者的臨床表現(xiàn)。前腦Ash1l缺失可導(dǎo)致突觸和神經(jīng)環(huán)路功能障礙，以及辨別行為障礙。
 

 

圖2 Ash1l^+/-小鼠表現(xiàn)出正常的學習能力，但辨別能力受損

 

 

Ash1l以細胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)活動依賴的突觸修剪過程

 

隨后，作者借助高爾基染色發(fā)現(xiàn)，1月齡的Ash1l^+/-小鼠皮層神經(jīng)元和背側(cè)紋狀體中棘神經(jīng)元（MSNs）的樹突棘密度顯著增加（圖3A），為研究這種現(xiàn)象是否源于突觸消除過程（synapse elimination）的減少，研究人員研究了Ash1^+/-小鼠原代皮層神經(jīng)元的突觸密度變化。用表達ChR2光敏蛋白的慢病毒載體（Lenti-CaMKIIa-ChR2）感染培養(yǎng)的神經(jīng)元，并用LED刺激（圖3B），發(fā)現(xiàn)WT神經(jīng)元在LED刺激后24h樹突突觸素（SYP）密度顯著降低，而Ash1l^+/-組則未觀察到這種現(xiàn)象（圖3C,D），提示了Ash1l可能介導(dǎo)了活動依賴的突觸修剪過程。活體成像結(jié)果顯示，Ash1l^+/-組培養(yǎng)的神經(jīng)元中，活性依賴的突觸消除過程被削弱。

 

此外，作者還研究了在小鼠新皮層中活性依賴的突觸消除，追蹤了聽覺皮層（auditory cortex, AUD）到后頂葉皮層（posterior parietal cortex, PTLp）長距離投射軸突的變化。研究人員將AAV-EF1a-DIO-EYFP注射在Rbp4-Cre小鼠AUD，特異性標記聽覺皮層L5神經(jīng)元（圖3H）。小鼠接受音調(diào)依賴的恐懼條件訓練，成像觀察軸突變化發(fā)現(xiàn)，聲調(diào)依賴的恐懼條件學習24h后，Ash1l^+/-::Rbp4-Cre小鼠“bouton”（突觸小結(jié)）的清除明顯低于WT小鼠，而“bouton”形成則保持不變（圖3H-J）。

 

為探究這種“突觸修剪”過程的缺失是否由Ash1l缺失神經(jīng)元的細胞自主效應(yīng)導(dǎo)致的，研究人員將AAV-hSyn-Cre和AAV-EF1a-DIO-EYFP注射于Ash1l^fl/fl小鼠右側(cè)AUD區(qū)（圖3K），對小鼠進行音調(diào)依賴的恐懼條件行為學范式訓練，在學習之后借助體內(nèi)成像技術(shù)追蹤突觸的變化，發(fā)現(xiàn)Ash1l缺失的神經(jīng)元中學習依賴的突觸的增加數(shù)量沒有發(fā)生改變，而學習誘發(fā)的突觸的減少數(shù)量顯著低于正常小鼠（圖3K-M）。這些數(shù)據(jù)提示了Ash1l以細胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)皮層神經(jīng)元的活動依賴的突觸修剪過程。
 

 

圖3 Ash1l以細胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)活動依賴的突觸修剪過程

 

 

Ash1l調(diào)控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表達

 

接下來，作者研究了其分子機制，通過對轉(zhuǎn)錄組分析及基因本體論（GO）分析發(fā)現(xiàn)，Eph受體EphA7在聽覺皮層和背側(cè)紋狀體中的表達均顯著下調(diào)（圖4A-C），基于此，研究人員進一步將EphA7作為參與Ash1l介導(dǎo)的突觸修剪過程的重要基因之一進行了研究。

 

Eph受體及其配體 Ephrin 統(tǒng)稱為Eph家族蛋白，是蛋白酪氨酸激酶家族中的最大成員。Eph/ephrin蛋白作為細胞表面分子，參與調(diào)節(jié)突觸的形成及神經(jīng)元的可塑性，EphA7是編碼Eph受體中14個受體蛋白基因之一，在皮質(zhì)發(fā)育和突觸功能中發(fā)揮重要作用。

 

隨后，研究人員借助音調(diào)依賴的恐懼條件行為學范式，在體內(nèi)/體外均發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-小鼠聽覺皮層活動依賴的神經(jīng)元中EphA7表達遠低于WT小鼠的（圖4D-I），提示了在Ash1l^+/-小鼠中EphA7活動誘導(dǎo)表達受損。
 

 

圖4 Ash1l調(diào)控幼鼠和成年小鼠中EphA7的表達

 

 

Ash1l通過拮抗EZH2-H3K27me3來調(diào)控EphA7的表達

 

進一步，作者探究Ash1l是如何參與調(diào)控EphA7活動誘導(dǎo)表達，通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）發(fā)現(xiàn)，Ash1l的直接靶點H3K36me2在WT和Ash1l^+/-小鼠AUD EphA7基因位點附近沒有明顯差異，然而H3K27me3信號（組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體PRC2催化的抑制性標記物）在Ash1l^+/-小鼠EphA7基因位點顯著增加（圖5A,B）。同時，Ash1l^+/-小鼠中H3K27ac（一個活躍的增強標記。H3K27ac與H3K27me3共享一個位置，存在拮抗作用。）表達持續(xù)下降，用NaB（組蛋白去乙酰化酶抑制劑）預(yù)處理培養(yǎng)的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，刺激Ash1l^+/-神經(jīng)元后H3K27ac升高，EphA7表達恢復(fù)（圖5C,D）。同樣地，行為學結(jié)果顯示，Ash1l^+/-小鼠中H3K27me3、EZH2（PRC2復(fù)合體的一個重要的催化酶）表達水平顯著增加（圖5E-G）。通過UNC1999（EZH1/2抑制劑）對培養(yǎng)的神經(jīng)元進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)Ash1l^+/-激活的神經(jīng)元中EphA7表達受到抑制的現(xiàn)象得到改善（圖5I）。上述結(jié)果提示了，Ash1l在活性依賴的PRC2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制累積中發(fā)揮拮抗作用，從而允許EphA7在激活的神經(jīng)元中表達。

 

圖5 Ash1l通過拮抗EZH2-H3K27me3沉默來調(diào)控EphA7的表達

 

 

EphA7高表達可改善Ash1l^+/-小鼠突觸修剪過程缺陷和行為異常

 

基于上述結(jié)果，研究人員研究了提高EphA7受體活性是否能改善Ash1l突變小鼠的突觸修剪過程缺陷和行為異常。Ephrin-A5是EphA7的高親和力配體，參與下游信號[3,4]。作者在培養(yǎng)的神經(jīng)元和小鼠聽覺皮層中應(yīng)用Ephrin-A5多聚體的Fc融合蛋白（Ephrin-A5 Fc）直接刺激EphA7活性[5,6]，發(fā)現(xiàn)改善了Ash1l突變小鼠的突觸修剪過程和行為異常（圖6）。
 

 

圖6 Ephrin-A5激活EphA7高表達Ash1l^+/-小鼠突觸修剪過程缺陷和行為異常

 

 

 

結(jié)論

本文借助轉(zhuǎn)基因模型鼠、多種行為學范式、光遺傳學技術(shù)、活體成像轉(zhuǎn)錄組分析及基因本體論分析等多種技術(shù)手段，研究發(fā)現(xiàn)前腦神經(jīng)元Ash1l單倍體不足可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生溝通困難、重復(fù)刻板行為、社交障礙等類似自閉癥樣表型，并機制上破壞活動依賴的突觸修剪過程，這是以細胞自主效應(yīng)方式介導(dǎo)的。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Ash1l可通過介導(dǎo)EZH2-H3K27me3去抑制作用提高EphA7的活性依賴表達，進而影響突觸消除過程，并改善Ash1l^+/-小鼠辨別能力障礙及行為障礙。該研究有助于深入了解ASD相關(guān)發(fā)病機制，為其干預(yù)治療提供了新的思路。

 

 

 

 

作者介紹及基金信息

 

 

正在上科大管吉松教授課題組進行合作研究的2017級博士研究生閆宇澤(清華大學)和上科大生命學院的田苗苗博士為本文的共同第一作者。上科大生命學院研究生 2016級陳琪楠、2017級郭修賢、2018級李萌、2019級周罡也對本研究做出了重要貢獻。管吉松教授、青島大學附屬醫(yī)院劉世國教授和清華大學熊巍教授為本文的共同通訊作者，研究得到中科院遺傳發(fā)育所吳青峰研究組、上海理工大學謝紅研究組的大力支持。研究也得到了上科大戚煒教授、范高峰教授和上海交通大學醫(yī)學院徐楠杰教授大量的有益幫助。

 

該研究受到科技部科技創(chuàng)新2030-重大項目資助，和自然科學基金項目以及上海市科委項目支持。

 

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原文鏈接:

https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(21)01090-4

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參考文獻

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