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      Neuron | 彭勃等人提出了驗證膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的基本原則,并證明NeuroD1不能介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程

      時間:2021-12-13 熱度:
      小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程的構(gòu)想

      中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞組成。與外周組織器官不同,成年后哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元幾乎不能再生。在神經(jīng)退行性病變中(如阿爾茲海默病、帕金森病、亨廷頓病和腦中風(fēng)等),神經(jīng)元會大量死亡。死亡的神經(jīng)元無法再生,從而造成不可逆的嚴(yán)重腦功能損傷。與靜態(tài)的神經(jīng)元不同,膠質(zhì)細胞具有一定的再生能力。研究人員提出通過病毒工具操控某個分子,誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞發(fā)生重編程(reprogramming;或轉(zhuǎn)分化:conversion),使其分化成神經(jīng)元,實現(xiàn)神經(jīng)元的原位再生(in situ regeneration)。從而利用一類可再生的細胞(膠質(zhì)細胞)補充損失的不可再生的細胞(神經(jīng)元),實現(xiàn)神經(jīng)退行性病變的治療。膠質(zhì)細胞的重編程現(xiàn)象首先由德國馬克斯·普朗克神經(jīng)生物學(xué)研究所的Magdalena Götz教授課題組闡述,他們在2002年報告了PAX6可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元1。隨后,一系列研究聚焦在該研究領(lǐng)域,包括德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心張春立課題組 (SOX2,2013),賓夕法尼亞州立大學(xué)的陳功課題組 (NeuroD1, 2014)2,HHMI的Marius Wernig和Thomas Südhof課題組 (ASCL1, 2014)3等。這些方案均是通過操控單個因子,將星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元。雖然星形膠質(zhì)細胞能夠再生,但是其再生能力相對較弱(即使在depletion-repopulation條件下,星形膠質(zhì)細胞平均每天僅能再生0.7%)4。因而,研究人員提出能否通過誘導(dǎo)其他再生能力強的膠質(zhì)細胞類型重編程為神經(jīng)元。
       
      小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)再生能力最強的膠質(zhì)細胞。復(fù)旦大學(xué)彭勃課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細胞于再殖條件下,能夠通過自我增殖的方式平均每天再生20%的細胞5。若是能通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程,那么將相當(dāng)于發(fā)現(xiàn)了一個無窮無盡的補給源,可用來大量補充受損的神經(jīng)元。來自日本的Kinichi Nakashima課題組,于2019年報道了通過慢病毒異源性表達NeuroD1,可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元6。然而,領(lǐng)域內(nèi)對該現(xiàn)象充滿爭議。主要爭議集中在其原理性上:(1)前人所發(fā)現(xiàn)的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程,兩類細胞均是來源于神經(jīng)外胚層譜系,由radial glia分化而來,親緣關(guān)系較近,可能會發(fā)生轉(zhuǎn)分化。而小膠質(zhì)細胞是由卵黃囊中的髓系細胞發(fā)育而來,發(fā)育譜系差別很遠。若能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程,則這是一類跨譜系的轉(zhuǎn)變,理論上是難以實現(xiàn)的。(2)前人所發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程的因子(如NeuroD1)均是radial glia分化過程中與細胞命運決定相關(guān)的因子。然而,NeuroD1并不表達在小膠質(zhì)細胞所在的髓系譜系中,跨譜系表達如此重要的先導(dǎo)因子(pioneer factor)能否有相應(yīng)的下游元件支撐神經(jīng)外胚層譜系細胞的命運決定亦存疑。同時,近期還存在關(guān)于NeuroD1介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程是否是實驗假象的重大爭議7。
       
      來自復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃課題組、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎課題組和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛課題組的研究人員開展的聯(lián)合攻關(guān),利用活細胞成像、嚴(yán)謹(jǐn)譜系追蹤和藥理學(xué)等多個手段對NeuroD1介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程現(xiàn)象進行了系統(tǒng)性探索,相關(guān)研究成果于2021年12月6日刊發(fā)在神經(jīng)科學(xué)頂級期刊Neuron上,標(biāo)題為NeuroD1 induces microglial apoptosis and cannot induce microglia-to-neuron cross-lineage reprogramming圖18。
       

      圖1 論文首頁


      證明膠質(zhì)細胞重編程的三個基本原則
       

      驚人且重大的結(jié)論必須進行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那笞C。在該研究中,研究人員提出了充分證明膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程所需的三個基本原則:
      (1)通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拿鞔_的(unambiguous)譜系追蹤,設(shè)置合理設(shè)計的對照組(well-designed control)證明,并排除存在病毒泄漏的可能性;
      (2)通過明確的(unambiguous)活體/活細胞成像證據(jù),觀察到膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變過程;
      (3)若是殺掉該類型的膠質(zhì)細胞,那么該因子所介導(dǎo)的膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化將不會發(fā)生。
       
      首先是譜系追蹤,研究人員利用他莫昔芬誘導(dǎo)CX3CR1-CreER::Ai14小鼠的幾乎所有小膠質(zhì)細胞特異性表達tdTomato(永久標(biāo)記,即使細胞命運發(fā)生轉(zhuǎn)變,依然會表達tdTomato)。接下來,通過慢病毒hCAG-NeuroD1-T2A-GFP或hCD68-NeuroD1-T2A-GFP感染小膠質(zhì)細胞。如果小膠質(zhì)細胞表達NeuroD1后能夠重編程為神經(jīng)元,那么將能發(fā)現(xiàn)一批tdTomato+GFP+神經(jīng)元。然而,該團隊并沒有發(fā)現(xiàn)這群雙熒光標(biāo)記陽性神經(jīng)元的存在(圖2)。為了充分驗證該現(xiàn)象,研究團隊在CX3CR1+/GFP小鼠腦內(nèi)引進CMV-DIO-mCherryforward-(NeuroD1-T2A-GFP)reverseCMV-DIO-mCherryforward-GFPreverse慢病毒用來感染腦細胞(圖3A)。若是NeuroD1能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程,則能在第一個病毒處理后觀察到GFP+神經(jīng)元,而作為對照組的第二個病毒將觀察不到。然而,不論是通過哪個病毒誘導(dǎo),均能觀察到很高比例的GFP+神經(jīng)元(圖3),說明前人所能觀察到的“小膠質(zhì)細胞起源神經(jīng)元”是來自于實驗假象。理論上,在經(jīng)過他莫昔芬誘導(dǎo)后,病毒僅會在小膠質(zhì)細胞中發(fā)生同源重組,從而表達GFP。但是,研究人員觀察到的現(xiàn)象說明利用病毒工具載體進行感染時,會伴隨有非特異性泄漏的風(fēng)險。非特異性病毒泄漏可能會導(dǎo)致對實驗結(jié)論的誤讀。
       

       

      圖2 In vivo microglia-specific lineage tracing does not support the microglia-to-neuron conversion.

       

       

      圖3 Lentivirus induces non-specific labeling in vivo, which may confound the microglia-to-neuron observation.

       

      在觀察小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)變過程方面,研究人員通過活細胞成像方式進行觀察,并沒有發(fā)現(xiàn)表達NeuroD1的小膠質(zhì)細胞發(fā)生到神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。恰恰相反,研究人員發(fā)現(xiàn)表達NeuroD1后,會引起小膠質(zhì)細胞的大規(guī)模死亡。通過BCL2途徑可以對抗由NeuroD1小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的死亡,說明其NeuroD1不僅不能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞重編程,而會誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的凋亡。這也很好解釋了為何前人和該研究團隊觀察到的“小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元”假象的比例很高(圖3C,>90%)的原因:成功表達NeuroD1的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)發(fā)生凋亡而死去,因而最后剩下的細胞大都是非特異性泄漏細胞。
       
      最后,研究人員通過CSF1R抑制劑PLX5622殺死腦內(nèi)99%的小膠質(zhì)細胞,發(fā)現(xiàn)即使在這種情況下,依然會有很高比例的“小膠質(zhì)細胞起源神經(jīng)元”,且比例與不殺小膠質(zhì)細胞的對照組相當(dāng)(圖4)。因此,研究結(jié)果更加確認(rèn)了前人所觀察到的“小膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程”并非真實情況,而是來自于病毒非特異性泄漏所產(chǎn)生的實驗假象(圖5)。
       

       

      圖4 Even under microglia depleted brain, the “microglia-converted neurons” are detected, reflecting a lentiviral leakage artifact. 

       

       

      圖5 該研究主要結(jié)論的總結(jié)。


      換/移植小膠質(zhì)細胞失控的分子開關(guān)


      復(fù)旦大學(xué)彭勃團隊利用小膠質(zhì)細胞的再生能力,開發(fā)了三種方案(Mr BMT, Mr PB和Mr MT),首次在全腦尺度上實現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的高效外源性移植/替換9-12。該方案可用于治療由小膠質(zhì)細胞突變引起的疾病。然而,細胞移植所面臨的挑戰(zhàn)之一是如何防止外源性細胞失控。在小鼠模型中,常用誘導(dǎo)白喉毒素(DT)表達的方式殺死特性類型的細胞。由于小鼠沒有白喉毒素受體,因而死亡細胞所釋放出的白喉毒素不會殺死鄰近的細胞。然而,由于人類細胞存在白喉毒素受體,因而該方案不能用于臨床實踐。由于NeuroD1可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡,因此該研究團隊提出通過體外改造的方式,在移植/替換的小膠質(zhì)細胞中放入誘導(dǎo)表達NeuroD1的元件。一旦移植/替換的小膠質(zhì)細胞失控,可以通過該分子開關(guān)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡,從而提升小膠質(zhì)細胞替換/移植的安全性。

       

      上海市精神衛(wèi)生中心饒艷霞博士為該論文的第一作者和共同通訊作者。復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)轉(zhuǎn)化研究院彭勃教授、復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院毛穎教授和上海市精神衛(wèi)生中心袁逖飛教授為共同通訊作者。該團隊多人為此研究做出貢獻。該研究主要得到了國家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金項目、國家重點研發(fā)計劃、上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人項目、上海市基礎(chǔ)研究學(xué)術(shù)特區(qū)項目和深圳市知識創(chuàng)新計劃的支持。
       
      彭勃課題組目前有青年副研究員(副教授)、博士后、實驗室管家的崗位空缺,歡迎對科研充滿熱情且胸懷學(xué)術(shù)理想的科研人員/學(xué)生加入。申請人請將一份詳細的個人完整簡歷(中英文皆可)通過電子郵件發(fā)送至peng@fudan.edu.cn,郵件標(biāo)題請注明姓名+應(yīng)聘職位。青年副研究員(副教授)和博士后應(yīng)聘者請?zhí)峁﹥蓚€推薦人的聯(lián)系方式。

       

      原文鏈接:

      https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(21)00944-2

       

      附:彭勃課題組2018-2021年發(fā)表的代表性論文

      (1) Rao Y.*, Du S., Yang B., Wang Y., Li Y., Li R., Zhou T., Du X., He Y., Wang Y., Zhou X., Yuan T.-F.*, Mao Y.* and Peng B.* (2021) NeuroD1 induces microglial apoptosis and cannot induce microglia-to-neuron cross-lineage reprogramming, Neuron, 109. 

      (2) Huang Y.#, Xu, Z.#, Xiong S., Sun F., Qin G., Hu G., Wang J., Zhao L., Liang Y.-X., Wu T., Lu Z., Humayun M.S., So K.-F., Pan Y., Li N., Yuan T.-F.*, Rao Y.* and Peng B.* (2018). Repopulated microglia are solely derived from the proliferation of residual microglia after acute depletion. Nature Neuroscience 21, 530-540.

      (3) Xu Z.#, Rao Y.#, Huang Y., Zhou T., Feng R., Xiong S., Yuan T.F., Qin S., Lu Y., Zhou X., Li X., Qin B., Mao Y., and Peng B.* (2020). Efficient strategies for microglia replacement in the central nervous system. Cell Reports 32, 108041. 

      (4) Huang Y.#, Xu Z.#, Xiong S., Qin G., Sun F., Yang J., Yuan T.F., Zhao L., Wang K., Liang Y.X., Fu L., Wu T., Lu Z., So K.F., Rao Y.* and Peng B.* (2018) Dual origins of retinal microglia in the model of microglia repopulation. Cell Discovery 4, 9.

      (5) Xu, Z., Zhou, X., Peng, B.*, and Rao, Y.* (2021). Microglia replacement by bone marrow transplantation (Mr BMT) in the central nervous system of adult mice. STAR Protocols 2, 100666.

      (6) Xu, Z., Rao, Y.*, and Peng, B.* (2021). Protocol for microglia replacement by peripheral blood (Mr PB). STAR Protocols 2, 100613. 

      (7) Xu, Z., Peng, B.*, and Rao, Y.* (2021). Microglia replacement by microglia transplantation (Mr MT) in the adult mouse brain. STAR Protocols 2, 100665. 


      九游會j9生物有幸提供實驗中使用的AAV及慢病毒載體,用實際行動助力中國腦科學(xué)的發(fā)展。
       


       

      參考文獻
       

      1.Heins, N. et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature neuroscience 5, 308-315, doi:10.1038/nn828 (2002).
      2.Guo, Z. et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell stem cell 14, 188-202, doi:10.1016/j.stem.2013.12.001 (2014).
      3.Chanda, S. et al. Generation of induced neuronal cells by the single reprogramming factor ASCL1. Stem Cell Reports 3, 282-296, doi:10.1016/j.stemcr.2014.05.020 (2014).
      4.Borges, K., McDermott, D., Irier, H., Smith, Y. & Dingledine, R. Degeneration and proliferation of astrocytes in the mouse dentate gyrus after pilocarpine-induced status epilepticus. Exp Neurol 201, 416-427, doi:10.1016/j.expneurol.2006.04.031 (2006).
      5.Huang, Y. et al. Repopulated microglia are solely derived from the proliferation of residual microglia after acute depletion. Nature neuroscience 21, 530-540, doi:10.1038/s41593-018-0090-8 (2018).
      6.Matsuda, T. et al. Pioneer Factor NeuroD1 Rearranges Transcriptional and Epigenetic Profiles to Execute Microglia-Neuron Conversion. Neuron 101, 472-485 e477, doi:10.1016/j.neuron.2018.12.010 (2019).
      7.Wang, L.-L. et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell, doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.005 (2021).
      8.Rao, Y. et al. NeuroD1 induces microglial apoptosis and cannot induce microglia-to-neuron cross-lineage reprogramming. Neuron 109 (2021).
      9.Xu, Z., Peng, B. & Rao, Y. Microglia replacement by microglia transplantation (Mr MT) in the adult mouse brain. STAR Protoc 2, 100665, doi:10.1016/j.xpro.2021.100665 (2021).
      10.Xu, Z., Zhou, X., Peng, B. & Rao, Y. Microglia replacement by bone marrow transplantation (Mr BMT) in the central nervous system of adult mice. STAR Protoc 2, 100666, doi:10.1016/j.xpro.2021.100666 (2021).
      11.Xu, Z., Rao, Y. & Peng, B. Protocol for microglia replacement by peripheral blood (Mr PB). STAR Protoc 2, 100613, doi:10.1016/j.xpro.2021.100613 (2021).
      12.Xu, Z. et al. Efficient Strategies for Microglia Replacement in the Central Nervous System. Cell reports 32, 108041, doi:10.1016/j.celrep.2020.108041 (2020).

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