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藥物濫用（如可卡因、阿片類(lèi)藥物）最初會(huì)帶來(lái)急性獎(jiǎng)賞效應(yīng)，即藥物的正性強(qiáng)化效應(yīng)，用藥后導(dǎo)致大腦功能的適應(yīng)性變化，且這種快感驅(qū)使個(gè)體進(jìn)一步攝取藥物；停藥后個(gè)體會(huì)產(chǎn)生不適的身體反應(yīng)以及煩躁、抑郁、易怒、焦慮等負(fù)面情緒。個(gè)體為了緩解這種不適會(huì)進(jìn)一步獲藥，即負(fù)性強(qiáng)化效應(yīng)。正性強(qiáng)化和負(fù)性強(qiáng)化的循環(huán)交替促進(jìn)藥物依賴(lài)的狀態(tài)。
嗎啡（morphine）是阿片類(lèi)藥物的一種。其衍生物鹽酸嗎啡是臨床上最常用的鎮(zhèn)痛劑，有極強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。然而，嗎啡具有易成癮這一危害極深的副作用。長(zhǎng)期使用嗎啡的患者會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的依賴(lài)性，如果停止用藥一段時(shí)間，會(huì)產(chǎn)生焦慮、抑郁等戒斷反應(yīng)。這些戒斷反應(yīng)會(huì)驅(qū)使患者使用更多嗎啡，形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重：α斯步】。
藥物從最初獎(jiǎng)賞過(guò)渡到藥物依賴(lài)的過(guò)程伴隨著大腦神經(jīng)環(huán)路可塑性的改變，中腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area, VTA）神經(jīng)元可塑性參與調(diào)控阿片類(lèi)藥物依賴(lài)和戒斷癥狀[1,2]，然而，目前尚不清楚影響?yīng)勝p的正性強(qiáng)化和戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化之間轉(zhuǎn)換的神經(jīng)環(huán)路重塑機(jī)制。
近日，復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院馬蘭/王菲菲團(tuán)隊(duì)在Molecular Psychiatry發(fā)表題為CRHCeA→VTA inputs inhibit the positive ensembles to induce negative affect of opiate withdrawal的最新研究工作[3]。該研究借助即早基因驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記了VTA中嗎啡激活的獎(jiǎng)賞神經(jīng)元集群（嗎啡神經(jīng)元集群），發(fā)現(xiàn)中央杏仁核（central amygdala, CeA）中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）神經(jīng)元通過(guò)抑制性環(huán)路調(diào)控VTA嗎啡神經(jīng)元集群，并介導(dǎo)嗎啡戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化效應(yīng)，闡明了成癮性藥物嗎啡負(fù)性強(qiáng)化環(huán)路和分子機(jī)制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預(yù)靶點(diǎn)，具有重要科學(xué)和社會(huì)意義。
1.VTA嗎啡神經(jīng)元集群以多巴胺依賴(lài)機(jī)制介導(dǎo)正性強(qiáng)化
首先，研究人員借助響應(yīng)神經(jīng)元活性的功能元件--E-SARE（synaptic activity-response elements， AAV-E-SARE-CreERT2）標(biāo)記中腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area, VTA）嗎啡初次暴露激活的神經(jīng)元集群（Mor-Ens, 嗎啡神經(jīng)元集群），發(fā)現(xiàn)VTA嗎啡神經(jīng)元集群偏向性地投射到伏隔核（the nucleus accumbens, NAc）腦區(qū)（圖1a-f）。
隨后，研究人員在小鼠VTA區(qū)注射AAV-E-SARE-CreERT2和AAV-DIO-hChR2-mCherry混合病毒并埋入光纖，借助顱內(nèi)自身刺激（intracranial self-stimulation, ICSS）系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，光激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群可引起小鼠鼻觸反應(yīng)次數(shù)增加，使用氟哌噻醇（flupenthixol 多巴胺拮抗劑）可抑制這一現(xiàn)象（圖1g-j）。同時(shí)，借助DA探針發(fā)現(xiàn)激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群能夠促進(jìn)NAc多巴胺的釋放（圖1k-o）。
上述結(jié)果提示了VTA嗎啡神經(jīng)元集群偏向性地投射到伏隔核（NAc）腦區(qū)，激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群能夠促進(jìn)NAc多巴胺的釋放，引發(fā)小鼠的自給光行為，介導(dǎo)了多巴胺依賴(lài)的正性強(qiáng)化效應(yīng)。
圖1 VTA嗎啡神經(jīng)元集群以多巴胺依賴(lài)機(jī)制介導(dǎo)正性強(qiáng)化
2.VTA嗎啡神經(jīng)元集群接收的抑制性輸入增強(qiáng)，介導(dǎo)戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化
接下來(lái)，借助全細(xì)胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，在慢性嗎啡暴露條件下，TH陽(yáng)性VTA嗎啡神經(jīng)元集群的mIPSC振幅和頻率顯著增加，提示了VTA多巴胺能嗎啡神經(jīng)元集群接受更多的抑制性輸入（圖2a-i）。
隨后，借助化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)和行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，hM4Di抑制VTA嗎啡神經(jīng)元活性會(huì)加重嗎啡戒斷誘發(fā)的條件位置厭惡和焦慮行為，而hM3Dq激活嗎啡神經(jīng)元集群能夠緩解嗎啡戒斷帶來(lái)的厭惡和焦慮負(fù)性情緒（圖2j-w），提示了編碼嗎啡獎(jiǎng)賞的正性神經(jīng)元集群功能受到抑制，是導(dǎo)致嗎啡負(fù)性強(qiáng)化的原因。
圖2 VTA嗎啡神經(jīng)元集群接收的抑制性輸入增強(qiáng)，介導(dǎo)戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化
3.激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負(fù)性情緒
研究發(fā)現(xiàn)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）參與戒斷期間相關(guān)行為，研究人員在CRH-Cre鼠VTA區(qū)注射 AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP，標(biāo)記在中央杏仁核（central amygdala, CeA）、終紋床核（bed nucleus of stria terminalis, BNST）和下丘腦室旁核（paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN）投射到VTA的CRH神經(jīng)元。慢性嗎啡處理后，CRHCeA→VTA和CRHBNST→VTA神經(jīng)元中c-Fos表達(dá)增加（圖3a-c）。
CeA是杏仁體主要的抑制性輸出部位，參與情緒加工[4-6]。因此，研究人員借助逆行示蹤病毒和電生理技術(shù)發(fā)現(xiàn)，嗎啡慢性給藥治療增加了CRHCeA→VTA神經(jīng)元mEPSC振幅和頻率，提高了神經(jīng)元興奮性(圖3d-j)。
隨后，研究人員在CRH-Cre鼠CeA區(qū)注射Cre依賴(lài)的光遺傳學(xué)病毒，并在VTA埋入光纖，借助條件性位置厭惡（conditioned place aversion, CPA）、高架十字迷宮（elevated-plus maze, EPM）和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open-field, OFT）行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，AAV-DIO-eNpHR3.0抑制CRHCeA→VTA投射通路可緩解嗎啡戒斷誘發(fā)的焦慮和厭惡負(fù)面情緒（3k-p），AAV-DIO-hChR2激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負(fù)性情緒（3q-v）。
圖3 激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負(fù)性情緒
4.慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經(jīng)環(huán)路重塑
進(jìn)一步，研究人員在CRH-Cre鼠VTA注射AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP和AAV-Retro-hSyn-tdTomato病毒，c-Fos共標(biāo)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)嗎啡慢性給藥增加了CeA腦區(qū)c-Fos+CRH+神經(jīng)元的比例（圖4a-c），提示了嗎啡慢性給藥對(duì)CRHCeA→VTA神經(jīng)元活性有特異性調(diào)節(jié)作用。
為研究CeA到嗎啡神經(jīng)元集群（Mor-Ens）的單突觸輸入，作者借助E-SARE元件和逆向跨突觸病毒系統(tǒng)標(biāo)記VTA輸入神經(jīng)元，并用熒光探針技術(shù)發(fā)現(xiàn)CeA crh陽(yáng)性神經(jīng)元偏向性地與嗎啡神經(jīng)元集群形成突觸連接（圖4d-g）。
接下來(lái)，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-mCherry，VTA區(qū)注射AAV-RAM-tTA-TRE-EGFP，借助Dox標(biāo)記體系和光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，嗎啡慢性給藥促使CeA中CRH神經(jīng)元向VTA多巴胺能嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性連接增強(qiáng)（圖4h-s）。
圖4 慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經(jīng)環(huán)路重塑
5.CRHCeA→VTA通路介導(dǎo)嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負(fù)面情緒的產(chǎn)生
隨后，研究人員借助RAM-tTA-TRE/DOX系統(tǒng)做進(jìn)一步驗(yàn)證，他們?cè)贑RH-Cre小鼠VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，CNO激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群導(dǎo)致了小鼠焦慮樣行為（圖5a-e），這與E-SARE-CreERT2TAM系統(tǒng)得到的結(jié)果一致。
為觀(guān)察VTA嗎啡神經(jīng)元集群的激活是否能緩解由CRHCeA→VTA連接增強(qiáng)引起負(fù)性情緒，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-EYFP，VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，借助CPA和EPM行為學(xué)范式發(fā)現(xiàn)，光遺傳激活CRHCeA→VTA通路導(dǎo)致的小鼠表現(xiàn)出條件性位置厭惡，同時(shí)進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)減少，表現(xiàn)出焦慮樣行為，而化學(xué)遺傳激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群則有效改善了這一現(xiàn)象（圖5f-j）。
圖5 CRHCeA→VTA通路介導(dǎo)嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負(fù)性情緒的產(chǎn)生
6.嗎啡神經(jīng)元集群的CRHR1受體介導(dǎo)CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發(fā)的負(fù)性情緒
由于光刺激可能觸發(fā)神經(jīng)元末梢的神經(jīng)肽釋放[7]。研究人員對(duì)CRH受體信號(hào)在CeA中CRH神經(jīng)元向VTA嗎啡神經(jīng)元集群抑制性輸入通路的潛在作用做進(jìn)一步研究。他們?cè)赩TA離體腦片做光遺傳操作和電生理記錄，發(fā)現(xiàn)CRHR1受體拮抗劑可顯著降低VTA嗎啡神經(jīng)元集群O-IPSCs（optical-evoked inhibitory postsynaptic currents, 光誘發(fā)抑制性突觸后電流）的振幅和頻率，提示了CRHR1受體介導(dǎo)了CRH信號(hào)參與嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入，揭示了CRH信號(hào)通路在CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群投射通路可塑性重塑中的重要作用（圖6a-f）。
最后，研究人員探究這種神經(jīng)環(huán)路的重塑涉及的具體分子機(jī)制，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)下調(diào)CRHR1的表達(dá)，在小鼠VTA區(qū)注射AAV-sgCrhr1-mcherry, AAV-RAM-tTA-TRE-Cre和AAV-DIO-saCas9病毒，單分子熒光原位雜交技術(shù)（smFISH）發(fā)現(xiàn)，VTA嗎啡神經(jīng)元集群中Crhr1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（圖6g-i）。同時(shí)，行為學(xué)范式結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRHR1缺失對(duì)于小鼠嗎啡戒斷時(shí)期的條件性位置厭惡、自發(fā)活動(dòng)以及糖水偏好行為無(wú)明顯變化，但是增加了小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)、懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）中小鼠掙扎時(shí)間以及社交評(píng)分，提示了VTA嗎啡神經(jīng)元集群中CRHR1參與嗎啡戒斷時(shí)期包括焦慮、抑郁、社交能力下降等負(fù)性情緒的發(fā)展（圖6j-p）。
此外，在CRH-Cre小鼠注射光遺傳病毒及RAM/DOX系統(tǒng)介導(dǎo)的CRISPR病毒發(fā)現(xiàn)，抑制嗎啡神經(jīng)元集群上的CRHR1受體顯著降低O-IPSC振幅，提示了下調(diào)CRHR1受體的表達(dá)，能顯著減弱CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入（圖6q-s）。
綜上，CRHR1受體參與CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入環(huán)路的突觸和功能重塑，介導(dǎo)了嗎啡戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化。
圖6 嗎啡神經(jīng)元集群的CRHR1受體介導(dǎo)CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發(fā)的負(fù)性情緒
本文中，作者首先借助即早基因驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記了VTA中嗎啡初次暴露激活的獎(jiǎng)賞神經(jīng)元集群（嗎啡神經(jīng)元集群），隨后，借助病毒載體示蹤技術(shù)、光遺傳學(xué)技術(shù)、化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)、神經(jīng)遞質(zhì)探針、電生理記錄、熒光原位雜交、行為學(xué)實(shí)驗(yàn)等多種技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)VTA嗎啡神經(jīng)元集群選擇性地投射到NAc，通過(guò)多巴胺依賴(lài)機(jī)制介導(dǎo)正性強(qiáng)化效應(yīng)，抑制這類(lèi)神經(jīng)元集群，會(huì)導(dǎo)致戒斷誘發(fā)的負(fù)性強(qiáng)化效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在嗎啡慢性給藥后，CeA腦區(qū)CRH神經(jīng)元與VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性突觸連接增強(qiáng)，從而介導(dǎo)了嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負(fù)性情緒的產(chǎn)生。最后，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)下調(diào)嗎啡神經(jīng)元集群上的CRHR1受體的表達(dá)可減弱CRHCeA→VTA的抑制性輸入，緩解嗎啡戒斷誘發(fā)的負(fù)面情緒。該研究闡明了成癮性藥物嗎啡負(fù)性強(qiáng)化環(huán)路和分子機(jī)制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預(yù)靶點(diǎn)，具有重要科學(xué)和社會(huì)意義。
復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院博士后江長(zhǎng)優(yōu)為本文的第一作者，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生楊霄和何觀(guān)虹為本文的共同第一作者。腦科學(xué)研究院的馬蘭教授與王菲菲教授為本文的通訊作者。本文的合作者還有來(lái)自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院的毛穎教授和徐文東教授。
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