利用10x Genomics Chromium微流控系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)通過(guò)序列標(biāo)簽區(qū)別不同細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄本。微流控系統(tǒng)通道直徑很小一次通過(guò)一個(gè)細(xì)胞。首先在通道中加入帶有標(biāo)簽的凝膠微珠，單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)帶有標(biāo)簽的凝膠微珠結(jié)合，二者被加入的油包裹到一個(gè)液滴中，形成油包水體系。凝膠微珠上帶有大量包含凝膠微珠特異性Barcode序列、分子特異性UMI序列和polyT序列的引物序列，將細(xì)胞裂解后mRNA分子被引物序列中的polyT捕獲，擴(kuò)增后形成攜帶有Barcode和UMI序列的cDNA，即可實(shí)現(xiàn)將不同細(xì)胞來(lái)源的不同mRNA分子加上標(biāo)簽。
Gel beads在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的作用是捕獲細(xì)胞中的mRNA，每個(gè)微珠表面攜帶有幾十萬(wàn)個(gè)Oligo序列（如下圖）。Oligo dT序列由4個(gè)部分組成：read1用于上機(jī)測(cè)序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一個(gè)Gel Beads都攜帶不同的barcode , 可標(biāo)記獲取的mRNA都來(lái)自于哪一個(gè)細(xì)胞；第三段UMI長(zhǎng)度為12bp, 可以將轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行絕對(duì)定量，避免擴(kuò)增產(chǎn)生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕獲有ployA尾的轉(zhuǎn)錄本。
對(duì)制備好的單細(xì)胞懸液先進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后與Gel Beads和油分別加入到Chromium Chip G的不同通道，經(jīng)由微流體“T字”交叉系統(tǒng)形成GEM。接著細(xì)胞裂解，Gel Beads自動(dòng)溶解釋放大量引物序列，與帶有PolyA的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成帶有10x Barcode和UMI信息的cDNA第一鏈。
樣本起始量與送樣建議
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組織類型 |
新鮮組織、新鮮懸液或速凍組織 |
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細(xì)胞大小 |
＜40 μm |
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細(xì)胞活性 |
>85%（盡量去除細(xì)胞團(tuán)/碎片/雜質(zhì)等） |
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細(xì)胞濃度 |
700~1200 cells/μL |
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細(xì)胞總量 |
＞5萬(wàn) |
注意事項(xiàng)：詳細(xì)樣本準(zhǔn)備指南，請(qǐng)聯(lián)系在線客服。
生物信息學(xué)分析內(nèi)容
代表性文章
【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：?jiǎn)渭?xì)胞分析顯示肝癌干細(xì)胞的異質(zhì)性
論文標(biāo)題：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
發(fā)表雜志：Hepatology
影響因子：14.079
研究機(jī)構(gòu)：美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院國(guó)家癌癥研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克國(guó)家癌癥研究實(shí)驗(yàn)室
樣本類型：肝癌細(xì)胞系（HuH1和HuH7) ，手術(shù)切除腫瘤樣本P1
技術(shù)手段：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分選
研究背景
肝細(xì)胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性部分歸因于肝癌干細(xì)胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。 由各種細(xì)胞表面標(biāo)志物定義的不同CSC群體可能包含不同的致癌驅(qū)動(dòng)因素，這在定義靶向療法時(shí)構(gòu)成了挑戰(zhàn)。 研究人員在單細(xì)胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和功能分析用以評(píng)估CSC的異質(zhì)性程度。結(jié)果表明，CSC在單細(xì)胞水平上的表型、功能和轉(zhuǎn)錄均存在異質(zhì)性性，不同的CSC亞群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亞群內(nèi)的不同基因與HCC預(yù)后相關(guān)，并且彼此相互獨(dú)立，表明CSC異質(zhì)性影響腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和腫瘤進(jìn)展。
文章結(jié)果
大量數(shù)據(jù)表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面標(biāo)志物可以定義CSC，研究人員選擇CD24、CD133、EpCAM分選HuH1和HuH7不同細(xì)胞亞群，用于研究CSC生物學(xué)和分子水平異質(zhì)性。免疫熒光染色表明，在兩種細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)下（單層培養(yǎng)、球體培養(yǎng)）,兩個(gè)HCC細(xì)胞系均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞異質(zhì)性。
HuH1和HuH7細(xì)胞系（原始細(xì)胞數(shù)分別是1343、1134）正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)（促進(jìn)細(xì)胞干性）2周后，研究人員依照三種表面標(biāo)志物（CD24、CD133、EpCAM）分選細(xì)胞，HuH1和HuH7中標(biāo)志物陽(yáng)性的CSCs比例分別為15-20%、8-12%，而標(biāo)志物陰性CSCs比例只有0-5%（下圖A-B），培養(yǎng)后不同細(xì)胞亞群的自我更新能力差異很大（下圖C-D）； 分選后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)1個(gè)月培養(yǎng)后，和未分的得細(xì)胞相比，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+細(xì)胞能夠擴(kuò)大成為混合CSCs，而存活下的Triple-細(xì)胞能夠擴(kuò)大成混合CSCs，可能是由于部分細(xì)胞不是真正的標(biāo)記陰性細(xì)胞，或者標(biāo)記陰性細(xì)胞經(jīng)歷了轉(zhuǎn)換變?yōu)闃?biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞（下圖E）。
研究人員采用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞以及分選的P1（分選CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-細(xì)胞）細(xì)胞表達(dá)譜（單個(gè)細(xì)胞測(cè)序、10細(xì)胞混合測(cè)序、100細(xì)胞混合測(cè)序）信息，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中人胚胎干細(xì)胞（hESC）、鼠內(nèi)皮細(xì)胞（mEC）和鼠造血干細(xì)胞（mHSC）表達(dá)譜數(shù)據(jù)做了比較，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞類群具有不同的基因表達(dá)模式，且不同類型細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)模式均存在差異，HuH7細(xì)胞間差異大于HuH1；當(dāng)細(xì)胞混合（10細(xì)胞混合、100細(xì)胞混合）后這種差異程度明顯降低（下圖A）。而當(dāng)單獨(dú)聚類HuH7細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)記細(xì)胞彼此可以區(qū)分（下圖B）。以上數(shù)據(jù)均表明單細(xì)胞水平上轉(zhuǎn)錄組存在異質(zhì)性。
研究人員比較了HuH7陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞（Triple+）和陰性標(biāo)記細(xì)胞（Triple-）基因表達(dá)差異，鑒定到的286個(gè)Triple+相關(guān)基因可以預(yù)測(cè)來(lái)自LCI隊(duì)列的240例腫瘤樣本、來(lái)自TCGA的250例腫瘤樣本的整體生存率，但在非腫瘤樣本中無(wú)意義。
不同標(biāo)記CSC細(xì)胞群體基因表達(dá)比較分析，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特征基因基本不重合（下圖A），IPA通路分析也表明不同細(xì)胞群體的通路也不重合（下圖C-F），而且不同細(xì)胞群體特征基因可以用于生存期預(yù)測(cè)，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有優(yōu)勢(shì)（下圖B）。
為了整體了解細(xì)胞群體多樣性，研究人員采用10X 單細(xì)胞測(cè)序方式，對(duì)3847個(gè)HuH1、HuH7、P1細(xì)胞進(jìn)行了分析， HuH1可以分為2個(gè)亞群，HuH7分為4個(gè)細(xì)胞亞群，P1分為3個(gè)細(xì)胞亞群，細(xì)胞聚類結(jié)果與與SMART-seq結(jié)果類似（下圖A）。CSC標(biāo)志物，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脫氫酶 (ALDH1A1) （下圖B）以及HCC特異基因，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下圖C）在不同細(xì)胞亞群中表達(dá)存在異質(zhì)性。P1的3個(gè)細(xì)胞亞群中表達(dá)了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC)， 干細(xì)胞marker (NANOG)，白細(xì)胞marker(PTPRC), T細(xì)胞 markers (CD3E, CD8A) 和B細(xì)胞marker (CD79A) ，但其表達(dá)也存在異質(zhì)性，其中第一個(gè)和第二個(gè)P1亞群為HCC浸潤(rùn)白細(xì)胞（分別表達(dá)T細(xì)胞marker和B細(xì)胞marker），第三個(gè)P1亞群主要為HCC細(xì)胞（下圖D）。
參考文獻(xiàn)
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
結(jié)果展示
1. 單細(xì)胞亞群分類
針對(duì)PCA結(jié)果中選取前10個(gè)主成分，采用graph-based聚類方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。使用相同的數(shù)據(jù)進(jìn)行t-SNE分析，然后將聚類結(jié)果在t-SNE映射中展示。
2. Marker基因分析
細(xì)胞群體Top10 Marker基因的小提琴圖和表達(dá)映射圖
3. 差異基因KEGG富集性分析
Pathway通路圖展示與說(shuō)明：紅色代表注釋到某個(gè)ko節(jié)點(diǎn)且上調(diào)的顯著差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，藍(lán)色代表注釋到某個(gè)ko節(jié)點(diǎn)且下調(diào)的顯著差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本，橘黃色代表注釋到某個(gè)ko節(jié)點(diǎn)不僅有上調(diào)又有下調(diào)的顯著差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。方框內(nèi)的4位數(shù)字表示各種酶的EC編號(hào)；空心圓圈表示小分子化合物；實(shí)心箭頭表示生化反應(yīng)的方向；虛線箭頭連接其他的相關(guān)代謝途徑。下圖僅為報(bào)告中的展示圖片
常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）
1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序需要做重復(fù)嗎？
單細(xì)胞測(cè)序的目的在于鑒定細(xì)胞群體中的不同亞群、得到新的重要分子標(biāo)志物和鑒定稀有細(xì)胞亞群等，因此更多的是關(guān)注細(xì)胞和細(xì)胞之間的差別。從目前已有的文獻(xiàn)看，對(duì)重復(fù)數(shù)沒(méi)有強(qiáng)制要求。但從近期的發(fā)文趨勢(shì)來(lái)看，建議每組設(shè)置樣本數(shù)3~5 個(gè)，臨床樣本根據(jù)實(shí)際情況建議每組 5 例以上。
2、組織樣本如何制備單細(xì)胞懸液？
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序目前沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的樣本制備方法，針對(duì)于不同的組織樣本，有不同類型的樣本單細(xì)胞制備方法。此外，可以具體根據(jù)老師提供的具體樣本類型，查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，探討適合于老師樣本的單細(xì)胞懸液制備方法。
3、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組每個(gè)細(xì)胞能捕獲到多少個(gè)基因？
根據(jù)不同的細(xì)胞類型，捕獲到的基因數(shù)會(huì)有區(qū)別，有些細(xì)胞類型高的會(huì)在3000左右，而有些大概在1000左右?；驒z出數(shù)與樣本狀態(tài)有關(guān)，不同類型的樣本，基因檢出數(shù)可能存在數(shù)倍的差異。
