DIA主要采用數(shù)據(jù)非依賴采集模式（DIA），結合傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA）構建參考譜圖庫，通過液質聯(lián)用技術（LC-MS/MS）將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息。隨后利用搜庫軟件進行蛋白組學的鑒定、定量分析等。
技術優(yōu)勢
靈敏度高，無歧視地獲得所有肽段的信息，不會造成低豐度蛋白信息的丟失，
循環(huán)時間固定，掃描點數(shù)均勻，定量準確度高，
重復性好，重復樣品間的定量相關性可達到0.99以上。
分析內容
1. 數(shù)據(jù)質控
2. 蛋白功能注釋：GO 注釋、COG 注釋、KEGG 注釋、結構域注釋
3.蛋白定量分析：蛋白定量結果、蛋白表達水平聚類分析、重復性分析
4. 蛋白差異分析：蛋白差異分析結果、差異蛋白火山圖、差異蛋白聚類熱圖
5. GO 富集分析：GO 富集結果、GO 富集柱狀圖、GO 富集有向無環(huán)圖、
6. KEGG 富集分析：KEGG 富集結果、KEGG 富集氣泡圖、KEGG 富集通路圖
7. 結構域富集分析：結構域富集結果、結構域富集柱狀圖、差異蛋白互作分析、
8. 差異蛋白互作分析
9. 轉錄組關聯(lián)分析
代表性文章
【1】Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.
【2】Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
案例展示
蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain
研究背景
慢性疼痛是一種治療方案有限的復雜疾病。雖對其發(fā)病機理進行了多次研究，但各結果間存在較大不一致性，主要受限于傳統(tǒng)蛋白質組shotgun技術固有的缺陷。發(fā)病機制依然不清晰。
實驗設計
炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛兩種模型鼠及其對應control鼠共4組，各3個生物學重復
每個生物學重復由10-13只鼠pooling而成
解剖獲得同側背根神經(jīng)節(jié)膜部分提取蛋白進行DIA蛋白定量
圖1 實驗設計類型
主要發(fā)現(xiàn)
1）DDA建庫鑒定到3067個蛋白，迄今鑒定數(shù)最多的背根神經(jīng)節(jié)蛋白研究。
2）DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個，其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個；SNI和Sham都鑒定到的2600個，表明實驗重復性較好。
3）炎癥性和神經(jīng)性疼痛差異蛋白分別為64和77，兩種模式共有差異蛋白為12個。
4）其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達量變化相反，表明兩種疼痛的調控機制不同。
5）western blot和免疫組化對上述DIA結果進行了驗證。
圖2 四組實驗模型的蛋白聚類分析
參考文獻
Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.
結果展示
結構域注釋柱狀圖
Interproscan是蛋白質結構域和功能注釋最常用的軟件之一。為了能更全面的進行結構域的注釋，Interproscan整合了一些最常用的結構域數(shù)據(jù)庫，包括 Pfam、 ProDom、 SMART 等結構域的數(shù)據(jù)庫，利用模式結構或特征進行功能未知蛋白的結構域注釋，繪制結構域注釋的柱狀圖。橫坐標代表蛋白數(shù)目，縱坐標代表注釋到的 IPR 條目。
蛋白表達水平聚類圖
蛋白表達水平聚類分析用于判斷不同實驗條件下蛋白表達量的相關性。每個樣品都會得到一個絕對或相對蛋白表達集合，將所有樣品表達集合并在一起，用于層次聚類分析和 K-means 聚類分析。
KEGG 富集通路圖
在 KEGG 通路圖中，圈出了差異蛋白，其中綠色底色框內為鑒定出的總蛋白，藍色框標記的是下調差異蛋白，紅色框標記的是上調差異蛋白，黃色框標記的是通路中該功能對應的多個蛋白中既有上調差異蛋白、也有下調差異蛋白。
差異蛋白互作分析
利用 StringDB 蛋白質互作數(shù)據(jù)庫進行鑒定蛋白的互作分析，若在數(shù)據(jù)庫中有相應的物種，則直接提取相應物種的序列，若無，則提取近源物種的序列，然后將差異蛋白的序列與提取出的序列進行 blast 比對，得出相應的互作信息，構建網(wǎng)絡圖。
常見問題
1. 蛋白定量DIA和傳統(tǒng)的非標記定量有何優(yōu)勢？
傳統(tǒng)的非標記定量一般需要通過分級的方法開展，耗時久、重復性差、數(shù)據(jù)結果可信度不高；蛋白定量DIA技術是新一代非標記定量技術，可通過更優(yōu)的數(shù)據(jù)采集模式，在相同時間采集到更豐富的信息，壓縮周期的同時，大福度提高樣本間平行比較的重復性，數(shù)據(jù)結果可信度極高。
