穩(wěn)定細胞株構(gòu)建

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外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天；一類是穩(wěn)定表達（構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株），外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可長期表達目的基因。

　　建立穩(wěn)定細胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標志進行篩選。最常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白、或穩(wěn)定沉默特定基因的細胞株。

篩選方法

慢病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株
利用慢病毒整合表達特性來篩選穩(wěn)定細胞株，該方法克服了傳統(tǒng)質(zhì)粒挑單克隆方法周期久的弊端，可以在短時間內(nèi)高效獲取穩(wěn)定細胞株。

利用慢病毒制備穩(wěn)定株優(yōu)勢
（1）細胞適用種類廣泛，可用于各種哺乳動物細胞；
（2）構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株時間短，表達持續(xù)時間長；
（3）多種熒光標記和抗性基因可。愎鄄饈笛橐。

HUVEC

HepG2

穩(wěn)定細胞株分類

　　混合克隆穩(wěn)定細胞株

　　混合克隆細胞系是基因轉(zhuǎn)染后直接用抗藥篩選得到的，篩選出的細胞都表達抗性基因和目的基因，但包含了各種不同的細胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表達量均有所不同。

　　混合克隆細胞株篩選比較快速，費用較低。在需要構(gòu)建的細胞株轉(zhuǎn)染效率高，目的基因表達效率高的情況下，單克隆細胞株最后得到的表達效果和混合克隆細胞株并沒有顯著差異，這時多克隆細胞篩選是理想的選擇。

　　單克隆穩(wěn)定細胞株

　　單克隆細胞系是由含有穩(wěn)定整合外源片段的單個細胞的擴增得到的細胞株，每個細胞的目的基因整合位置的表達量均高度一致，但可能丟失一些表型。單克隆細胞株篩選周期長，費用高。需要進行細胞亞定位實驗的細胞系，難感染的和表達率低的通常建議進行單克隆細胞篩選。

服務流程

目的基因名稱，種屬等信息
載體需求（抗性、熒光、便簽等）
目的細胞等信息
其它特殊需求
細胞預實驗
質(zhì)粒構(gòu)建表達檢測
慢病毒包裝與純化
穩(wěn)定株篩選及鑒定
構(gòu)建好的穩(wěn)定株
穩(wěn)定株構(gòu)建說明書
構(gòu)建的質(zhì)粒，病毒等

已構(gòu)建的穩(wěn)定株列表（部分）

中文名稱	對應穩(wěn)定株	對應培養(yǎng)條件	細胞來源
人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤	U-87 MG-luc-mNeonGreen-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人膠質(zhì)瘤細胞	U251-CMV-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人膀胱移行細胞癌細胞	T24-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人胰腺癌細胞系	SW 1990-EGFP-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人神經(jīng)母細胞瘤細胞	SK-N-SH-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+0.4ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細胞	SK-BR-3-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人子宮頸鱗癌細胞	SiHa-CMV-EGFP-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠腦神經(jīng)瘤細胞	Neuro-2a-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠腦神經(jīng)瘤細胞	Neuro-2a-CMV-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細胞	MDA-MB-468-EGFP-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細胞	MDA-MB-231-CMV-EGFP-Luc-Puro	L-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人乳腺癌細胞	MCF7-CMV-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠肺癌細胞	LLC-CMV-sfGFP-Luc-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人慢性髓原白血病細胞	K-562-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人T淋巴細胞白血病細胞	Jurkat-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+0.5ug/ml Puromycin	中科院
人子宮內(nèi)膜癌細胞	ishikawa-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細胞	HuH-7-CMV-sfGFP-Luc-Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細胞	HuH-7-Luc Puro	DMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細胞	HT-29-EGFP-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細胞	Hep G2-CMV-EGFP-Luc-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人肝癌細胞	Hep G2-CMV-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人宮頸癌細胞	HeLa-EGFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人宮頸癌細胞	HeLa-RFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細胞	HCT 116-CMV-EGFP-Luc-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人咽鱗癌細胞	FaDu-CMV-EGFP-Puro	MEM+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠結(jié)腸癌細胞	CT26.WT-CMV-Luc-Puro	RPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin	中科院
小鼠結(jié)腸癌細胞	CT26.WT-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin	中科院
人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞	Caki-1-EGFP-Puro	DMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
倉鼠腎成纖維細胞	BHK-21 [C-13]-CMV-Puro	MEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人甲狀腺乳頭狀癌細胞	B-CPAP-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1%NEAA+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠黑色素瘤細胞	B16-CMV-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠黑色素瘤細胞	B16-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
人非小細胞肺癌細胞	A549-CMV-EGFP-Puro	F12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人非小細胞肺癌細胞	A549-luc-mNeonGreen-Puro	F12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
小鼠乳腺癌細胞	4T1-CMV-Luc-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
小鼠乳腺癌細胞	4T1-CMV-EGFP-Puro	RPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin	中科院
人胃癌細胞	MKN-45-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	RPMI-1640+20%FBS+2ug/ml Puromycin	協(xié)和
人肺腺癌細胞	NCI-H1975-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	RPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院
人結(jié)腸癌細胞	HCT116-CBh-luc2-mNeonGreenA-Puro	McCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin	中科院