時間：2021-04-14 熱度：

癡呆癥是一種表現(xiàn)為記憶、思考、行為和日?；顒幽芰λネ说木C合征。世界衛(wèi)生組織資料顯示，全世界大約有5000萬癡呆癥患者，每年新增病例1000萬。阿爾茨海默。ˋlzheimer's disease, AD）是一種與年齡相關的慢性中樞神經退行性疾。淺沾糝⒆畛＜男問，約占癡呆癥病例的60-70%。中國癡呆患者人數(shù)居世界第一，據估計約有950萬，到2030年中國癡呆患者將會達到1600萬。AD主要的病理特征包括淀粉樣蛋白聚集形成的老年斑(Senile plaques, SPs)、Tau蛋白異常聚集形成的神經原纖維纏結 (Neurofibrillary tangles, NFTs)以及大量神經元丟失。AD病程進展緩慢，早期癥狀常被認為是普通的健忘而被忽視。AD患者晚期認知功能能力逐漸喪失，伴隨人格異常以及各種行為功能障礙，最終導致死亡。突觸是神經元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位，神經元突觸結構動態(tài)變化為學習記憶重要的結構基礎。突觸活動可以刺激蘑菇狀樹突棘（在突觸傳遞和認知功能中起關鍵作用）的成熟并形成新的突觸，使突觸強度能夠適應環(huán)境的變化，反過來又在學習和記憶中發(fā)揮重要作用[1-3]。AD患者中早期階段就已經出現(xiàn)突觸丟失和突觸功能障礙，與SPs和NFTs相比，以突觸丟失和突觸活動降低為特征的突觸功能障礙與AD的認知障礙有著更高的相關性[4-5]。因此，了解突觸功能障礙的潛在機制將有助于開發(fā)早期AD的治療藥物。

MicroRNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為22bp的非編碼單鏈RNA分子，具有在翻譯水平調控基因表達的功能。miRNA參與多種生理病理過程，他們能夠精確調節(jié)突觸上突觸相關蛋白的局部翻譯。先前的研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者的腦組織或血清中有大量miRNA表達失調，與淀粉樣斑塊和神經纖維纏結的形成以及突觸可塑性異常相關。然而，這些miRNA導致AD突觸功能障礙的具體機制仍然未知。

2021年3月26日，華中科技大學腦研究所、基礎醫(yī)學院病理生理系朱鈴強教授、魯友明教授研究團隊在《Nature Communications》發(fā)表題為“miR-135a-5p mediates memory and synaptic impairments via the Rock2/Adducin1 signaling pathway in a mouse model of Alzheimer’s disease”的最新研究工作[6]。該研究發(fā)現(xiàn)，導致AD記憶混亂的罪魁禍首miRNA——miR-135a-5p，其通過調控下游靶蛋白Rock2異?；顒?，影響Add1在Ser726位點磷酸化水平，最終導致突觸功能障礙及學習記憶能力受損。揭示了miR-135a-5p/Rock2信號通路參與AD早期突觸病變，為AD治療藥物的開發(fā)提供新的思路。



結果


1、AD模型小鼠miR-135a-5p表達異常降低

首先，作者對AD模型小鼠海馬組織中與突觸活性相關的miRNA進行表達譜測序及篩選驗證，結果發(fā)現(xiàn)，12月齡的AD模型小鼠中miR-135a-5p表達下調，而miR-136-3p、miR-19a-3p、miR-125b-5p和miR-26a-5p的表達明顯上調（圖1a），此外，9月齡的AD模型小鼠中只檢測到miR-135a-5p的下調以及miR-125b-5p的表達上調（圖1b）。這些數(shù)據提示了miR-135a-5p的下調或miR-125b-5p的上調可能參與調控AD疾病的早期發(fā)病過程。由于miR-125b-5p在AD中的功能障礙已得到充分的證明[7]。因此，研究人員將重點研究miR-135a-5p在AD突觸紊亂中的可能作用。

隨后，作者檢測了不同年齡段的APP/PS1小鼠（AD模型小鼠的一種）海馬區(qū)miR-135a- 5p水平的變化，發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p的這種下調從6月齡就開始存在了，只是在9月齡的模型小鼠中miR-135a-5p下調更為明顯（圖1c）。同時，借助熒光原位雜交技術發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p的表達下調主要發(fā)生在AD模型小鼠海馬的興奮性神經元中（圖1d,e）。

進一步，作者在體外培養(yǎng)的原代神經元中過表達Tau、APP或PS1后，發(fā)現(xiàn)了miR-135a-5p水平下調的現(xiàn)象（圖1f）。而在AD模型小鼠海馬區(qū)Tau蛋白的表達水平與miR-135a-5p的表達水平呈負相關（圖1g,h），這提示了miR-135a-5p在AD中的丟失具有Tau依賴性。

圖1 AD模型小鼠海馬區(qū)miR-135a-5p表達異常降低


為找到AD中miR-135a-5p下調的原因，作者首先通過放線菌素D阻斷新RNA的合成來檢測miR-135a-5p的穩(wěn)定性，結果發(fā)現(xiàn)，在AAV-Tau感染的海馬原代神經元中miR-135a-5p的半衰期與對照病毒感染的神經元相同（圖2a,b），這提示了Tau過表達對miR-135a-5p的抑制不是由RNA降解功能障礙引起的。接下來，作者考慮了AD中miR-135a-5p的轉錄是否受到抑制，研究人員檢測了Tau蛋白過表達的原代海馬細胞核部分中miR-135a-5p轉錄本(pri-miR-135a-1/2)的水平，發(fā)現(xiàn)pri-miR-135a-1降低（圖2c），在APP/PS1模型鼠中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象（圖2d），這提示了pri-miR-135a-1的轉錄受到抑制，可能是導致AD中miR-135a-5p表達下調的原因。進一步，作者通過雙熒光素酶報告、ChIP及相關數(shù)據庫發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白誘導的miR-135a-5p表達下調是由于Foxd3轉錄因子減少導致的（圖2g-l）。



圖2  AD模型小鼠中miR-135a-5p表達下調是由于Foxd3轉錄因子減少導致


2、miR-135a-5p表達下調通過影響突觸結構功能導致學習記憶障礙


接下來，作者借助AAV病毒載體在6月齡野生型小鼠海馬區(qū)抑制miR-135a-5p（AAV- sponge（miR-135a-5p）），1個月后對小鼠的空間記憶和突觸可塑性進行了評估（圖3a,b），通過Morris水迷宮、巴恩斯（Barnes maze）迷宮、條件性恐懼實驗（Fear Conditioning）行為學范式發(fā)現(xiàn)，抑制miR-135a-5p后，小鼠的空間記憶能力受損，學習記憶障礙，具有阿爾茨海默樣表型（圖3）。


圖3 抑制miR-135a-5p的表達可導致小鼠學習記憶障礙


海馬的突觸可塑性是學習記憶的基礎[8]，研究人員也發(fā)現(xiàn)抑制miR-135a-5p的表達后，CA3-CA1環(huán)路的突觸傳遞功能出現(xiàn)了異常，即興奮性突觸后電位抑制從而導致了LTP（長時程增強）突觸可塑性異常，而突觸前囊泡釋放并未受明顯影響，提示了miR-135a-5p表達降低阻滯了突觸傳遞（圖4a-d）。同時，高爾基染色結果發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p表達下調后也會導致樹突棘密度減少，尤其是在突觸傳遞和認知功能中起關鍵作用的蘑菇狀樹突棘數(shù)量減少（圖4e-g），此外，神經元樹突復雜性也降低（圖4h-j）。這些結果提示了miR-135a-5p表達水平降低導致AD小鼠中出現(xiàn)突觸異常現(xiàn)象，miR-135a-5p可能通過影響突觸結構功能進而影響學習記憶能力。


圖4 抑制miR-135a-5p的表達可導致小鼠突觸功能障礙


3、miR-135a-5p表達下調導致Rock2異常激活

miRNAs通過抑制其靶mRNAs的翻譯或促進其降解來調控基因表達[9]?；诖?，為明確miR-135a-5p介導AD突觸紊亂的直接靶點，研究人員通過多個數(shù)據庫對比發(fā)現(xiàn)四個潛在候選分子（Rock1、Rock2、Cacna1d和Pik3r2），而在APP/PS1小鼠中只有Rock2（Rho關聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶2）發(fā)生顯著上調變化（圖5a），提示了Rock2是介導miR-135a-5p表達下調導致的突觸異常的潛在下游靶點。體外細胞實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p能直接與Rock2的3’UTR結合，miR-135a-5p的表達上調或下調能夠調控Rock2的蛋白表達水平，提示了miR-135a-5p對Rock2具有直接調控作用（圖5b,c）。

接下來，研究人員探討了Rock2激活后介導的AD突觸異常的潛在下游效應因子。借助生信分析，在9月齡的APP/PS1小鼠以及培養(yǎng)的海馬原代神經元中均發(fā)現(xiàn)了內收蛋白1（adducin 1, Add1）的Thr445和Ser726的磷酸化顯著增加（圖5d,e）。同時，在AD患者和AD小鼠的額葉皮質中，磷酸化Ser726-Add1水平升高，并伴隨著Rock2的表達水平增加，且miR-135a-5p與Rock2、Ser726-Add1磷酸化水平呈較強的負相關，而Rock2與Ser726-Add1呈正相關（圖5f-i）。提示了miR-135a-5p的表達下調導致了Rock2的異常激活，進一步通過上調Add1在Ser726位點磷酸化水平使細胞骨架異常。



圖5 miR-135a-5p的表達下調導致Rock2的異常激活


4、恢復miR-135a-5p/ Rock2信號通路可以改善AD的記憶損傷和突觸功能異常



基于上述結果，研究人員進一步驗證miR-135a-5p的上調或Rock2的下調是否可以改善AD模型小鼠的記憶損傷和突觸障礙。通過向8月齡的APP/PS1小鼠海馬注射LV-shRNA（Rock2）和miR-135a-5p的激動劑，發(fā)現(xiàn)這兩種方式均能Rock2的表達、降低Add1在Ser726位點磷酸化水平、恢復樹突棘的密度和復雜度，促進樹突棘成熟（圖6a-g），同時，突觸傳遞功能及小鼠的學習記憶障礙也得到了改善（圖6h-m）。


圖6 過表達miR-135a-5p可改善AD小鼠的記憶損傷和突觸障礙



最后，作者驗證了阻斷Add1的磷酸化水平是否可以改善AD模型小鼠的記憶損傷和突觸障礙。通過體外驗證，研究人員找到siP-Add1能減弱Add1的磷酸化水平（圖7a），并通過腹腔注射于APP/PS1小鼠后發(fā)現(xiàn)siP-Add1可降低小鼠體內Ser726-Add1磷酸化水平，同時改善了阿爾茲海默樣表型（圖7b-o）。


綜上，miR-135a-5p/Rock2信號通路也許就是介導AD早期突觸功能異常以及記憶損傷的原因之一，恢復miR-135a-5p/ Rock2信號通路可以改善AD的記憶損傷和突觸功能異常。



圖7 siP-Add1可降低小鼠體內Ser726-Add1磷酸化水平，同時改善了阿爾茲海默樣表型





結論

文中朱鈴強教授/魯友明教授研究團隊借助病毒載體介導的基因過表達/干擾技術、分子生物學手段、多種行為學范式、生信分析、表達譜測序、雙熒光素梅檢測等技術手段發(fā)現(xiàn)，導致AD記憶混亂的罪魁禍首miRNA——miR-135a-5p。在AD的早期發(fā)病階段miR-135a-5p表達下調，進一步其通過調控下游靶蛋白Rock2的異常激活，影響Add1在Ser726位點磷酸化水平，最終導致突觸功能障礙及學習記憶能力受損。揭示了miR-135a-5p/Rock2信號通路參與AD早期突觸病變，為AD治療藥物的開發(fā)提供新的思路。

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-22196-y

參考文獻
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