光遺傳學(xué)（optogenetics）是結(jié)合了光學(xué)（optics）及遺傳學(xué)（genetics）的技術(shù)，借助其，九游會j9能在活體動物甚至是自由運(yùn)動的動物腦內(nèi)、脊髓、外周神經(jīng)內(nèi)，精準(zhǔn)地控制特定種類神經(jīng)元的活動。光遺傳學(xué)在時間上的精確度可達(dá)到毫秒級別，在空間上的精確度則能達(dá)到單個細(xì)胞級別。2010年，光遺傳學(xué)被Nature Methods選為年度方法，同年被Science認(rèn)為是近十年來的突破之一。這項(xiàng)技術(shù)目前在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，未來可能會應(yīng)用于多種神經(jīng)和精神疾病的治療，如帕金森氏病、阿爾茨海默病、癲癇、脊髓損傷、精神分裂癥等。
光遺傳學(xué)技術(shù)基本原理
簡單地說，光遺傳學(xué)技術(shù)即借助遺傳學(xué)手段，將能夠?qū)馄痦憫?yīng)的通道蛋白表達(dá)在特定細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)通過光來激活或抑制神經(jīng)元活動的目標(biāo)。其中，激活或抑制的原理在于不同通道對陽離子或陰離子的通透：如果轉(zhuǎn)入細(xì)胞的通道是ChR通道，那么在細(xì)胞接受藍(lán)色激光照射時通道開放，陽離子內(nèi)流，會產(chǎn)生去極化電位，誘發(fā)動作電位的發(fā)出，激活細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)入細(xì)胞的是HR一類通道的話，細(xì)胞接受黃色激光照射時陰離子內(nèi)流，產(chǎn)生超極化電位，導(dǎo)致動作電位不易發(fā)放，抑制細(xì)胞活動；此外，還有一類光激活或抑制的通道optoXR，給光激活后其改變的是胞內(nèi)激酶系統(tǒng)，影響細(xì)胞活動。因此，光遺傳學(xué)技術(shù)的核心技術(shù)差異在于光敏感通道的選擇。
光遺傳學(xué)的基本原理（Karl Deisseroth, et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2014）
常見的光敏感通道
幾種激活神經(jīng)元的通道蛋白：
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ChR2(H134R)：470nm藍(lán)光激發(fā)。ChR2的突變體，該蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生兩倍的光電流，但通道開關(guān)速度也比野生的ChR2慢了一倍。
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ChETA：470nm左右藍(lán)光激發(fā)。ChR2的突變體，具有更快的動力學(xué)變化，某些神經(jīng)元在激光刺激下可以發(fā)放200Hz的spike。
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oChIEF：450nm-470nm藍(lán)光激發(fā)。在某些神經(jīng)元中可以響應(yīng)高頻光（--100Hz）刺激，加速通道關(guān)閉的速度，在持續(xù)光照刺激下減少失活率。
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ChR2(C128S/D156A)：ChR2的突變體，SFO光敏通道，用470nm激活通道，然后用590nm激光關(guān)閉通道，可以打開其離子通道長達(dá)30分鐘。
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C1V1：540nm-560 nm激發(fā)。紅移視蛋白，該通道蛋白類型更利于雙光子激發(fā)。
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Chronos：500-530nm激發(fā)。高光敏度及快速開關(guān)動力學(xué)。
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ChrimsonR：590-600nm激發(fā)。做了K176R的點(diǎn)突變，增加了通道的關(guān)閉速度，適合用于刺激頻率較高的場合。
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ST-ChroME：530nm左右激發(fā)，胞體定位，激活型ChroME通道。
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ChRger：470nm藍(lán)光激發(fā)。相對無創(chuàng)（光纖放置在顱骨表面）。
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幾種抑制神經(jīng)元活動的通道蛋白
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eNpHR3.0：589nm黃光激發(fā)。第一個有效抑制神經(jīng)元活動的光遺傳學(xué)工具，在黃綠激光照射下會將氯離子打進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)，而抑制神經(jīng)元活動。當(dāng)把NpHR表達(dá)在哺乳動物腦內(nèi)時，會聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，因此，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出元件、高爾基體輸出元件和來自于鉀離子通道Kir2.1的上膜元件加在NpHR基因序列后面，這樣就能實(shí)現(xiàn)在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的高量聚集，修改過的NpHR被稱為eNpHR3.0，因此，eNpHR3.0 對細(xì)胞膜的靶向性較好，電流較為持久，響應(yīng)時間短，反應(yīng)靈敏。
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Arch：566nm左右激發(fā)。即為archaerhodopsin，是一種黃色激光激活的外向整流質(zhì)子泵，能夠?qū)д姷馁|(zhì)子從神經(jīng)元內(nèi)移動到細(xì)胞外環(huán)境中，使神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)。在特定條件下，可用于增加細(xì)胞內(nèi)pH或減少細(xì)胞外基質(zhì)pH。和NpHR相比，當(dāng)激光關(guān)閉的時候，Arch立即從通道打開狀態(tài)恢復(fù)到關(guān)閉狀態(tài)。
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Mac：540nm激發(fā)。即為 Leptosphaeria maculans fungal opsins，是一種能夠?qū)д姷馁|(zhì)子從神經(jīng)元內(nèi)移動到細(xì)胞外環(huán)境中的質(zhì)子泵，使神經(jīng)元處于超極化狀態(tài)。
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Jaws：632nm激發(fā)，紅移視蛋白，紅光照射下會使氯離子內(nèi)流，從而抑制神經(jīng)元活動。
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ST-eGtACR1：515nm激發(fā)。GtACR是一個Cl-通道，效率比NpHR、Arch等離子泵高很多，快速抑制。適合照光時間特別短、行為效應(yīng)特別短的情況。ST-eGtACR1為其胞體定位版本。
常見光敏感通道特性（Karl Deisseroth’s, Nat Methods,2012）
光遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用策略
借助病毒載體的光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用一般包括以下幾個關(guān)鍵步驟：
1、 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求尋找合適的光敏蛋白；
2、通過病毒載體感染細(xì)胞，將光敏感通道表達(dá)在靶細(xì)胞中；
3、手術(shù)手段向腦中導(dǎo)入光纖，通過控制激光來實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元活動的精準(zhǔn)控制；
4、選擇合適的病毒表達(dá)時間，結(jié)合行為實(shí)驗(yàn)設(shè)置合理的試驗(yàn)方案；
5、行為學(xué)手段或電生理手段驗(yàn)證。
光遺傳學(xué)技術(shù)的一般策略（Karl Deisseroth, Scientific American, 2010）
光遺傳學(xué)技術(shù)在嚙齒類動物中的應(yīng)用案例
Yan-Gang Sun’s lab. Science 2017[1]
注射部位：小鼠脊髓
載體：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry& AAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP
血清型：rAAV2/9
病毒滴度：5.1× 1012 VG/mL&1.7× 1013 VG/mL
注射體積：400-600nl
Zhong Chen’s lab. Nat Commun, 2020[2]
注射部位：PV-Cre小鼠的SNr區(qū)
載體：PV-Cre: AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry & AAV-CAG-FLEX-ArchT-GFP
病毒滴度：1.7× 1013 VG/mL&1.3× 1012 VG/mL
注射體積：200nl
光遺傳學(xué)非人靈長類（NHP）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資源庫
光遺傳學(xué)技術(shù)的出來可以幫助科研人員更深入的理解大腦與行為之間的神經(jīng)機(jī)制，目前關(guān)于光遺傳學(xué)的應(yīng)用主要集中在嚙齒類小動物模型，為了最大限度的發(fā)揮光遺傳學(xué)的潛力，使其成為研究人類認(rèn)知和行為的重要工具，然而，在這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于人類之前，謹(jǐn)慎的做法是先在非人類靈長類動物(non-human primates, NHPs)身上證明其安全性和有效性。NHPs的解剖學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)和行為學(xué)特征比任何其他動物模型更接近人類。NHP與人類之間的同源性使其成為理解人類大腦功能和障礙的最佳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。利用光遺傳學(xué)從NHPs的細(xì)胞水平、環(huán)路水平及大腦網(wǎng)絡(luò)層面去解析神經(jīng)機(jī)制，有望揭示人類大腦功能和障礙的基本機(jī)制。
然而，在非人靈長類動物上使用光遺傳學(xué)存在不少技術(shù)障礙，比如對于病毒載體、啟動子和視蛋白的選擇，以及注射劑量等等。由于嚙齒動物和NHP之間的解剖學(xué)和遺傳學(xué)差異，意味著那些在嚙齒動物中使用的光遺傳學(xué)策略在NHP中并不總是有效，對于想要開展NHPs光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究人員來說，實(shí)驗(yàn)的操作指南很少。
使用光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)表的文章數(shù)
基于此，2020年10月19日賓夕法尼亞大學(xué)Sébastien Tremblay在《Neuron》在線發(fā)表題為An Open Resource for Non-human Primate Optogenetics的文章[3]，綜述了光遺傳在非人靈長類動物模型中的最新進(jìn)展，該文章總結(jié)了世界各地45個實(shí)驗(yàn)室，1000多個注射實(shí)驗(yàn)的方法和結(jié)果（包括未發(fā)表的數(shù)據(jù)），整合成光遺傳學(xué)非人靈長類動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資源庫，以幫助擴(kuò)大光遺傳學(xué)在NHPs中的應(yīng)用。
該數(shù)據(jù)庫包含6種不同品系的NHP，其中大部分實(shí)驗(yàn)在恒河猴（71%）上進(jìn)行；使用最多的病毒載體為AAV2/5型（36%），其次是AAV2/9型（13%）；使用最廣泛的啟動子為CaMKIIa（37%，特異性標(biāo)記投射神經(jīng)元），其次為hSyn（22%，特異性標(biāo)記成熟神經(jīng)元）和CAG（11%，廣譜表達(dá)啟動子）。 此外，在NHP中應(yīng)用最廣泛的報告基因?yàn)镋YFP（45%），其次為GFP（17%）和mCherry（13%）。
同時，該數(shù)據(jù)庫還分析了在NHP中最常用的到光遺傳視蛋白：約39%使用激活型視蛋白--hChR2(H134R)、約25%使用抑制型視蛋白，這其中包括6%的ArchT、6%的Jaws。
隨后，研究人員通過解剖學(xué)、生理學(xué)、行為學(xué)手段來評估光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)在NHPs中的成功率：
發(fā)現(xiàn)，在食蟹猴（88%）的成功率最高，而AAV2/9和AAV2/8M(Y733F) 的成功率最高，分別為93%和88%，此外，對啟動子分析發(fā)現(xiàn)，用CMV和CaMKIIa進(jìn)行NHPs光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的成功率最高，分別為85%和84%。
在視蛋白方面，eNpHR3.0的成功率最高，為88%；C1V1(T/T)，其成功率約為86%，hChR2(H134R)，在397次的注射實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生了85%的成功率。
一般認(rèn)為，較慢的注射速度可以減少對腦組織的創(chuàng)傷，此外，由于NHPs腦相較于嚙齒類動物腦更大更復(fù)雜，病毒載體的注射體積也會影響實(shí)驗(yàn)效果。
從該數(shù)據(jù)庫中分析了注射速率從6 nL/min到5000 nL/min的成功實(shí)驗(yàn)，多數(shù)集中在200 nL/min。注射體積多數(shù)為1-3uL。
光遺傳學(xué)技術(shù)優(yōu)勢
1、 時間精確度高：光遺傳技術(shù)可以通過控制激光使時間精準(zhǔn)度到毫秒級別甚至是亞毫秒級；
2、 刺激的強(qiáng)度精確性高：光遺傳技術(shù)通過控制激光，可以精準(zhǔn)地、隨時地調(diào)節(jié)給神經(jīng)元刺激的強(qiáng)度，這對于某些刺激強(qiáng)度依賴的神經(jīng)環(huán)路研究有不可替代的優(yōu)勢；
3、 空間特異性：光遺傳學(xué)技術(shù)可以通過腦定位注射、特異性啟動子、甚至是亞細(xì)胞器定位肽，將光敏感蛋白錨定在靶向細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行操作，可達(dá)到單個細(xì)胞的級別，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位；
4、 作用工具多樣：目前人們已經(jīng)突變了一系列新的光敏感通道，這些通道的時間特性和激發(fā)光要求都不同，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇；
5、 作用直接：不像DREADDs技術(shù)依賴于動物代謝水平，光遺傳學(xué)技術(shù)通過激光操控細(xì)胞的激活或抑制，作用直接。
參考文獻(xiàn)
[1] Science. 2017 Aug 18;357(6352):695-699. doi: 10.1126/science.aaf4918.
[2] Nat Commun. 2020 Feb 17;11(1):923. doi: 10.1038/s41467-020-14648-8.
[3] Neuron. 2020 Oct 12;S0896-6273(20)30751-0. doi: 10.1016/j.neuron.2020.09.027.
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