隨著基因編輯技術(shù)和基因遞送載體等技術(shù)的逐步提高與完善，在腫瘤治療、罕見(jiàn)病等基因治療主戰(zhàn)場(chǎng)的巨大市場(chǎng)前提下，越來(lái)越多本土和跨國(guó)制藥企業(yè)布局基因和細(xì)胞治療行業(yè)。截至2020年9月，ClinicalTrails.gov官網(wǎng)顯示全球已有超過(guò)4310項(xiàng)基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)，隨著項(xiàng)目的臨床推進(jìn)，病毒的大規(guī)模生產(chǎn)已成為基因治療產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素。
 

在基因治療項(xiàng)目中，AAV等病毒通過(guò)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。目前的生產(chǎn)方式主要有貼壁培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)以及懸浮培養(yǎng)。由于貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)方式有著本質(zhì)不同，如細(xì)胞的形態(tài)、代謝、生長(zhǎng)行為等，目的產(chǎn)物的質(zhì)量與產(chǎn)量會(huì)受到極大影響。因此，選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，對(duì)于大規(guī)模病毒載體生產(chǎn)具有越來(lái)越重要的意義。本文主要介紹了貼壁、微載體、懸浮三種工藝在病毒生產(chǎn)中的應(yīng)用。

貼壁培養(yǎng)以細(xì)胞工廠為例，細(xì)胞工廠相較于傳統(tǒng)的細(xì)胞瓶，可節(jié)省更多人力、物力、時(shí)間、空間，方便按比例擴(kuò)增；節(jié)省空間，受污染風(fēng)險(xiǎn)低，批間差異小；減低勞動(dòng)強(qiáng)度和密集度，快速替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)。
 

微載體培養(yǎng)結(jié)合了貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)各自的優(yōu)點(diǎn)，提供了極大的培養(yǎng)表面積/體積比，提供了高的細(xì)胞產(chǎn)量而無(wú)需憑借大容量的設(shè)備，使得細(xì)胞在貼壁狀態(tài)實(shí)現(xiàn)了懸浮培養(yǎng)。對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)而言，微載體培養(yǎng)需要相當(dāng)少的空間，就可生產(chǎn)一定量的細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物，不僅減少了勞動(dòng)力需求，又降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。

在1L反應(yīng)器中進(jìn)行微載體培養(yǎng)工藝確認(rèn)，各參數(shù)如下表所示,AAV的滴度曲線如下圖所示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，上清和細(xì)胞沉淀的滴度均不斷上升，但細(xì)胞滴度更為明顯，120h可達(dá)4.5 E+11v.g/ml，約上清的3-4倍，且滴度較Spinner更高。該結(jié)果說(shuō)明了Spinner中的微載體工藝可以在1L反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)，同時(shí)驗(yàn)證了AAV的微載體的病毒生產(chǎn)工藝適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

  

懸浮培養(yǎng)容易實(shí)現(xiàn)全過(guò)程密閉操作，過(guò)程無(wú)菌控制簡(jiǎn)單；取樣簡(jiǎn)便、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單可控；便于放大、污染率和成本低；容易更換培養(yǎng)液，采用灌流培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度生長(zhǎng)；可實(shí)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)，減少由血清帶來(lái)病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，在懸浮培養(yǎng)模式下，通過(guò)大體積生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞通常是最便捷的方式。
 

以重組腺病毒為例，采用無(wú)血清懸浮293細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)多個(gè)關(guān)鍵因素的優(yōu)化，滴度從最初的1.00 E+9 PFU/mL 提高至5.20 E+9 PFU/mL，產(chǎn)量提高約5倍，有效實(shí)現(xiàn)大規(guī)模無(wú)血清懸浮培養(yǎng)腺病毒載體。

 

 

 

同一種細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)和貼罐培養(yǎng)時(shí)對(duì)同一病毒的敏感性不同；同一株細(xì)胞不同的克隆對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有不同的需求，對(duì)病毒敏感性亦可能不同。 常根據(jù)毒株特性，綜合考慮所用毒株能在何種細(xì)胞上增殖、表達(dá)，懸浮或貼壁細(xì)胞屬性足否適合大規(guī)模培養(yǎng)，規(guī)模和技術(shù)是否影響表達(dá)的穩(wěn)定性等因素選擇合適的宿主細(xì)胞及合適的培養(yǎng)工藝。
 

通過(guò)不斷的工藝摸索，九游會(huì)j9成功建立貼壁、懸浮和微載體培養(yǎng)工藝平臺(tái)，可適用于不同類型病毒載體的生產(chǎn)，且通過(guò)工藝優(yōu)化均能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

九游會(huì)j9生物將助力2020 BPID生物藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會(huì)，于2020年11月2日-3日在蘇州凱賓斯基酒店拉開(kāi)帷幕。本次大會(huì)將有近百位國(guó)內(nèi)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)鏈的權(quán)威意見(jiàn)領(lǐng)袖發(fā)言，數(shù)百家領(lǐng)先的生物創(chuàng)新藥企業(yè)密切關(guān)注，逾千位醫(yī)藥領(lǐng)域的同行報(bào)名參加。大會(huì)聚焦抗體藥物、細(xì)胞與基因治療、預(yù)防和治療性疫苗、干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)等熱門生物醫(yī)藥領(lǐng)域，滿足參會(huì)者在產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中對(duì)臨床前藥效毒理、臨床試驗(yàn)和商業(yè)化生產(chǎn)以及產(chǎn)業(yè)落地、投融資的全方位需求。

九游會(huì)j9生物誠(chéng)摯邀請(qǐng)您參觀我司展位(T6)，我司可提供基因治療和細(xì)胞治療用質(zhì)粒及重組病毒載體CDMO服務(wù)等，屆時(shí)歡迎各位領(lǐng)導(dǎo)前來(lái)指導(dǎo)交流。11月3日上午11:45-12:15在細(xì)胞與基因治療分論壇，有九游會(huì)j9公司總經(jīng)理賈國(guó)棟博士的關(guān)于多元化載體開(kāi)發(fā)迎接基因治療挑戰(zhàn) 的演講，屆時(shí)歡迎大家前來(lái)討論交流。
 

 

九游會(huì)j9生物基因和細(xì)胞治療載體CDMO平臺(tái)可提供從非注冊(cè)臨床研究用質(zhì)：筒《舊、基因治療新藥臨床申報(bào)整體方案到基因治療臨床樣品及商業(yè)化GMP生產(chǎn)的整體服務(wù)，服務(wù)產(chǎn)品包括基因和細(xì)胞治療用質(zhì)粒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、腺病毒、多種溶瘤病毒以及基因疫苗等新型基因載體。
 

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