承接上文對溶瘤腺病毒、皰疹病毒和溶瘤麻疹病毒臨床階段所面臨的挑戰(zhàn)分析，本文將繼續(xù)對三種不同類別的
溶瘤病毒進行剖析。
細小病毒 H1-PV（Parvoviruses）
嚙齒源細小病毒，特別是H1-PV病毒，其本身的穩(wěn)定性、安全性、跨膜能力和血清型多樣性等特點對抗腫瘤藥物的研發(fā)很有吸引力，其中的一部分特性也同時影響了H1-PV臨床級別的病毒生產(chǎn)、純化和質(zhì)量控制流程。
首先，H1-PV的自然感染能力較低，與人類疾病的聯(lián)系較少，有助于保證相關操作人員的安全。此外，細小病毒具有耐高溫性，在較為極端的pH環(huán)境中也較為穩(wěn)定，這些特性減少了對相關操作的環(huán)境要求。在這些特性以外，病毒制備和生產(chǎn)過程中的具體步驟也同時依賴于H1-PV的物理、化學和生物學特性，包括：
1.病毒的物理結(jié)構(gòu)，基因組結(jié)構(gòu)較為緊湊，使得在純化和滅菌過程中的過濾步驟較容易實現(xiàn)；
2.成熟的H1-PV可以在脂類溶劑中較為穩(wěn)定地存在，有助于病毒的純化和釋放過程；
3.實心和空殼的H1-PV的密度區(qū)分較為明顯，使得其可以通過梯度離心的方式分離濃縮；
4.相較于其他病毒，細小病毒較能承受伽馬射線滅活過程；
5.人源細胞可用于高效的H1-PV生產(chǎn)，從而避免了微生物和免疫原性動物蛋白的污染風險；
6.可適用于懸浮培養(yǎng)工藝，有助于工藝放大和產(chǎn)量提高；
當前的H1-PV的批次生產(chǎn)雖然已經(jīng)符合了有關標準，但是仍存在提高的空間。其中，可以通過對生產(chǎn)用細胞系和生產(chǎn)工藝進行選擇和調(diào)試，使得大規(guī)模生產(chǎn)在無血清條件下得到優(yōu)化。通過密度離心的方式分離較大的病毒目前較為困難，色譜提純的流程設計和開發(fā)有助于縮短細小病毒提純所需時間。這些因素都有助于提高臨床樣品H1-PV的感染能力。
呼腸孤病毒 （Reovirus）
呼腸孤病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，較易于在腫瘤細胞中復制，并通過激活Ras信號通路的方式來裂解腫瘤細胞。這種選擇性的細胞裂解是通過抑制dsDNA激活的蛋白激酶的自身磷酸化，使得細胞自身的抗病毒機制失活，從而達到裂解的目的。有研究課題組已經(jīng)證明呼腸孤病毒誘導的腫瘤細胞裂解刺激了由先天免疫激活和適應性免疫反應組成的有效的抗腫瘤免疫反應。
在溶瘤呼腸孤病毒的生產(chǎn)開發(fā)過程中，曾面臨過的最大挑戰(zhàn)是尋找一種適合的無動物源細胞培養(yǎng)基，以用于早期的工藝開發(fā)。這種培養(yǎng)基是用于優(yōu)化HEK293細胞的懸浮培養(yǎng)，而不是直接地用于優(yōu)化病毒的生產(chǎn)。但是該培養(yǎng)基的局限在于其本身不支持細胞生長超過2x106 cell/mL。由于其中含有酚紅，干擾了陰離子交換的提純步驟，累積的氨也阻礙了呼腸孤病毒的脫殼和反應器中病毒的產(chǎn)量。來自加拿大的Oncolytics Biotech公司與第三方合作開發(fā)了一種優(yōu)化型培養(yǎng)基，以用于呼腸孤病毒生產(chǎn)的優(yōu)化，盡可能規(guī)避上述問題。
痘苗病毒 （Vaccinia Virus）
痘苗病毒是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，基因組較大（~190kb），在人類血清中較為穩(wěn)定。人們對天花疫苗200年以上的發(fā)展研究提供了大量有關痘苗病毒安全性的數(shù)據(jù)，使得痘苗病毒作為一種溶瘤病毒的可能性及發(fā)展方向充滿吸引力。此外，痘苗病毒可以容納并表達超過50kb的治療性目的基因，并且通過研究，人們已經(jīng)知悉了多種在人和嚙齒類動物體內(nèi)痘苗病毒的抗腫瘤機制。
盡管取得了令人欣喜的結(jié)果，且某些溶瘤痘苗病毒藥物已經(jīng)進展到了臨床III期階段，溶瘤痘苗病毒的廣泛商業(yè)化仍然存在著挑戰(zhàn)與考驗。像其他溶瘤病毒藥物平臺一樣，在大劑量注射試驗中，靜脈注射之后患者體內(nèi)需要監(jiān)控腫瘤內(nèi)部的病毒濃度。為了達到大劑量生產(chǎn)規(guī)模，貼壁式培養(yǎng)腫瘤細胞往往被視作生產(chǎn)痘苗病毒最有效的方式。為了滿足法規(guī)要求，需要對病毒產(chǎn)品進行廣泛測試以確保最終產(chǎn)品中沒有致癌性DNA的存在。另外，痘苗病毒與細胞密切相關，需要破碎細胞和酶消化步驟從細胞碎片中釋放痘苗病毒，以減少來自宿主細胞的污染源。還需要強調(diào)的是，在GMP生產(chǎn)中，需要對擁有較大體積的痘苗病毒進行過濾，且保證無菌操作。使得具有包膜結(jié)構(gòu)的病毒濃縮、穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝策略，才可以更有效地給患者提供溶瘤病毒產(chǎn)品。
Fig 1. 溶瘤病毒產(chǎn)品從實驗室規(guī)模到臨床階段的轉(zhuǎn)化的關鍵步驟。
(Ungerechts, G. et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development 3, 16018 (2016))
結(jié)語：溶瘤病毒生產(chǎn)的未來方向
對于不同的溶瘤病毒而言，成熟且易于放大的生產(chǎn)工藝始終是臨床治療級別溶瘤病毒藥物的發(fā)展方向，應從主細胞庫和主毒株庫開始，逐步建立穩(wěn)定的、符合GMP規(guī)范的工藝步驟流程。在傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)以外，嘗試使用微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)生物反應器為主的工藝，可能在GMP規(guī)范下提高病毒滴度。另外需要強調(diào)的是，由于病毒本身特性及生產(chǎn)工藝的要求，統(tǒng)一的、標準化的下游純化工藝可能并不能適用于每一種溶瘤病毒藥物。
質(zhì)量控制一直是GMP生產(chǎn)要求的重要部分，需要對采樣、標準規(guī)格制定、測試、文件記錄和放行流程等具體步驟進行監(jiān)控保證。在上游開發(fā)過程中，選擇豐富的溶瘤病毒種類的同時，功能性基因及靶點的選擇和改造需要研發(fā)人員的不斷創(chuàng)新，以突破專利壁壘的限制。此外，全過程無菌的生產(chǎn)工藝應成為發(fā)展溶瘤病毒工藝的重要要求及發(fā)展方向。
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