時間：2020-08-06 熱度：

從20世紀(jì)70年代起，基因工程技術(shù)的發(fā)明帶動了基因傳輸、獲取和編輯等與基因療法密切相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)的開發(fā)，一些重要的基因工程技術(shù)如基因載體技術(shù)、基因克隆技術(shù)、基因編輯技術(shù)等給現(xiàn)代基因療法技術(shù)帶來了深刻的影響。

上篇中，為大家介紹了基因療法的發(fā)展歷程以及國內(nèi)對該領(lǐng)域的發(fā)展布局；以下，繼續(xù)將對目前基因療法領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展以及現(xiàn)行的相關(guān)法規(guī)政策進行一個大致的概述。
目前，基因療法領(lǐng)域最熱門的技術(shù)可以說是AAV載體遞送技術(shù)、CRISPR基因編輯技術(shù)、單/雙堿基編輯技術(shù)以及溶瘤病毒基因改造技術(shù)等。
腺相關(guān)病毒(AAV)最早于在20世紀(jì)60年代中期從實驗室腺病毒(AdV)制劑中發(fā)現(xiàn)，隨后很快就在人體組織中被發(fā)現(xiàn)。它具有無致病性、高效的長期基因表達(dá)、易于基因操作以及免疫反應(yīng)低(或在許多情況下缺乏)的特點，這一系列特性使其成為基因遞送的重要工具。
目前，前沿的AAV基因組設(shè)計能夠?qū)⒁職ぶ袛y帶的單鏈DNA設(shè)計成自我互補的序列。這種序列的優(yōu)點在于它不需要單鏈DNA復(fù)制成為雙鏈DNA的步驟就可以進行轉(zhuǎn)錄，與傳統(tǒng)的單鏈AAV基因組相比，它的基因表達(dá)更為迅速，而且表達(dá)量更高。諾華公司開發(fā)的治療脊髓性肌肉萎縮癥（SMA）的Zolgensma就使用了這種基因組設(shè)計。然而這種設(shè)計的一個缺點是AAV攜帶的轉(zhuǎn)基因容量減半，還需要進一步研究優(yōu)化。

至今為止，全球已有三款以重組AAV為載體的基因治療藥物獲批上市，除了諾華公司的Zolgensma（AAV9）以外，另外兩款是UniQure公司開發(fā)的Glybera（AAV1）和SparkTherapeutics公司開發(fā)的Luxturna（AAV2）；另外還有一款治療A型血友病的AAV基因治療藥物BMN-270（來自BioMarin）也提交了上市申請。由此九游會j9可以看出AAV基因療法的潛力是巨大的。
作為基因編輯工具，CRISPR已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的最熱門技術(shù)。早在20世紀(jì)下半葉，CRISPR序列就已經(jīng)被科研人員發(fā)現(xiàn)并記錄 ，直到2002年，這些序列正式被命名為：規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）。
2012年8月，Doudna與Charpentier兩個團隊合作在Science雜志發(fā)表了關(guān)于利用CRISPR/Cas系統(tǒng)在體外對DNA進行精確切割的具有開拓性的研究論文：他們可以使用這種CRISPR/Cas9系統(tǒng)在任何想要的地方切割任何基因組。

隨后，取得進一步進展的是麻省理工學(xué)院(MIT)和哈佛大學(xué)的Broad研究所的華人學(xué)者張峰，其研究組于2013年2月刊登的一篇論文表明：CRISPR/Cas9可用于編輯小鼠細(xì)胞或人類癌細(xì)胞的基因組。在同一期的Science期刊上，哈佛大學(xué)的George Church和他的團隊展示了如何使用CRISPR技術(shù)來編輯不同的人體細(xì)胞，包括正常人的iPS細(xì)胞。

從那時起，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9的功能非常多樣。科學(xué)家不僅可以使用CRISPR通過剪斷基因來“沉默”基因，還可以利用修復(fù)模板將剪切片段留下的縫隙替換為所需的基因。

隨后，科學(xué)家們對CRISPR技術(shù)進行了多方面的改進研究，截止2017年，關(guān)于CRISPR的論文，就已經(jīng)有超過14,000篇。目前，該技術(shù)發(fā)展的相當(dāng)成熟，已經(jīng)廣泛運用于基因療法領(lǐng)域，有望幫助各類遺傳性基因疾病患者獲得新的治療途徑。
現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)，例如CRISPR、ZFN、TALEN，通過在DNA中產(chǎn)生靶向的雙鏈斷裂，然后依靠細(xì)胞自身修復(fù)機制來完成編輯過程；這些方法可以有效地改變基因表達(dá)。然而，它們?nèi)狈庉嫿Y(jié)果的控制，脫靶效應(yīng)以及對DNA雙鏈斷裂的依賴，可能導(dǎo)致基因編輯后的細(xì)胞出現(xiàn)不可預(yù)期的混亂。許多基因組突變發(fā)生在單個堿基中，為使基因編輯更加精確，單堿基基因編輯技術(shù)應(yīng)運而生，旨在針對這些單一的堿基錯誤(即點突變)，而不會在DNA中造成雙鏈斷裂。

2016年4月，David Liu教授團隊在Nature上發(fā)表的論文表示，首次開發(fā)出了胞嘧啶堿基編輯器（CBE），能夠在不依賴DNA雙鏈斷裂的情況下首次實現(xiàn)了對單個堿基的定向修改。這便開啟了CRISPR系統(tǒng)的單基因編輯時代。隨后，David Liu教授團隊又開發(fā)了另一種單堿基基因編輯工具——腺嘌呤堿基編輯器（ABE），從此研究人員首次實現(xiàn)了不依賴于DNA斷裂而能夠將DNA四種堿基A、T、G、C進行替換的單堿基基因編輯技術(shù)。

但科學(xué)家們在隨后的研究過程中發(fā)現(xiàn)，單堿基編輯系統(tǒng)存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，同時會誘導(dǎo)大量基因突變，另外還存在著編輯窗口單一、編輯轉(zhuǎn)化效率不高等缺點，故而對其展開了一系列的優(yōu)化改善研究；2019年10月，David Liu團隊再次開發(fā)出先導(dǎo)編輯器(Prime Editor, PE)，一種能夠搜索和替換（堿基）的基因編輯器，在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換（C→T、G→A、A→G、T→C、C→A、C→G、G→C、G→T、A→C、A→T、T→A和T→G），此外還能有效實現(xiàn)多堿基的精準(zhǔn)插入。

2020年6月，國內(nèi)邦耀生物與華東師范大學(xué)劉明耀教授及李大力教授團隊合作的一項研究表明，將胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突變體）融合在一起，開發(fā)出的一種新型雙功能堿基編輯器-命名為：A&C-BEmax，不僅可以實現(xiàn)單獨的C>T或A>G，還可以在同一等位基因上同時實現(xiàn)C>T和A>G的高效轉(zhuǎn)換。雙堿基基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)極大地豐富了堿基編輯工具、擴展了堿基編輯器的應(yīng)用范圍，為遺傳病治療、作物育種等于帶來新的發(fā)展，可以說是人類在基因編輯領(lǐng)域新的突破。
溶瘤病毒（Oncolytic Virus, OV）是一類能選擇性感染和殺傷腫瘤細(xì)胞的病毒，具有特異性復(fù)制能力，并能激發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。它們的作用原理主要是通過對自然界存在的一些致病力較弱的病毒進行基因改造制成特殊的溶瘤病毒，利用靶細(xì)胞中抑癌基因的失活或缺陷從而選擇性地感染腫瘤細(xì)胞，在其內(nèi)大量復(fù)制并最終摧毀腫瘤細(xì)胞。
溶瘤病毒療法最初發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)初期，活躍于20世紀(jì)中期的大量臨床試驗，但由于當(dāng)時技術(shù)有限，主要都是利用天然的溶瘤病毒，其引發(fā)的強烈免疫反應(yīng)和并發(fā)癥導(dǎo)致效果不佳、副作用大，使得當(dāng)時化療和放療顯示出了顛覆性的療效，故而該領(lǐng)域受到冷落。

后來，隨著病毒學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，使得人們能對病毒基因進行改造，這大大提高了溶瘤病毒在腫瘤治療方面的效果、特異性和安全性。之后，溶瘤病毒就開啟了腫瘤治療的新紀(jì)元——溶瘤病毒療法。

隨著重組病毒基因組改造技術(shù)的逐漸成熟，溶瘤病毒療法技術(shù)已廣泛運用于實踐。其里程碑事件，是2015年美國FDA和歐盟批準(zhǔn)溶瘤病毒T-Vec上市；目前T-Vec已在美國、歐洲和澳大利亞廣泛用于復(fù)發(fā)黑色素瘤治療。近幾年，該領(lǐng)域似乎重新回歸到大家的視野中，成為國內(nèi)外基因療法研發(fā)領(lǐng)域的星星之火，值得期待。

基因治療監(jiān)管政策于1993年首次出臺，由國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的“基因工程安全管理措施”為起步進行推行。隨后在不斷發(fā)展中，21世紀(jì)初，中國形成了相對全面但仍然寬松的基因治療監(jiān)管政策，涉及藥物臨床試驗、基因治療質(zhì)量控制、輔助生殖、倫理審查、干細(xì)胞等多方面管控。

2010年，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《藥品臨床試驗倫理審查指導(dǎo)原則》。2015年，國家食品藥品監(jiān)督管理局與國家衛(wèi)生和計劃生育委員會聯(lián)合發(fā)布了監(jiān)管措施和道德準(zhǔn)則，例如干細(xì)胞臨床研究管理措施（試行），質(zhì)量控制和治療指導(dǎo)原則。同年，國家衛(wèi)計委取消了對第三類醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用的行政審批，因此細(xì)胞療法和基因療法可以由醫(yī)療機構(gòu)自行批準(zhǔn)。

但在2016年，我國發(fā)生了關(guān)于生物免疫療法的“魏則西事件”之后，國家衛(wèi)計委立即暫停了所有未經(jīng)批準(zhǔn)的第三類醫(yī)療技術(shù)的臨床應(yīng)用，并且對基因治療領(lǐng)域采取了更嚴(yán)格的監(jiān)管政策。

盡管如此，基因療法作為一種新的生物醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)，仍然屬于國家重點發(fā)展的領(lǐng)域。隨后，國務(wù)院在“十三五”國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（國發(fā)[2016] 67號）中，對基因治療領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)發(fā)展制定了激勵政策。但是當(dāng)時，中國尚未就人類基因技術(shù)問題（包括基因治療）形成一套全面而系統(tǒng)的法律法規(guī)體系。

2018年，受賀建奎的“CRISPR基因編輯嬰兒事件”影響，中國開始加強生物安全，基因技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的立法。2019年，《生物安全法》通過了全國人民代表大會常務(wù)委員會的第一次審查。該法律的目標(biāo)是成為生物安全的基礎(chǔ)、系統(tǒng)、全面和主導(dǎo)的基本法。

2019年，在中央全面深化改革第九次會議上，審議通過了《國家科技倫理委員會組建方案》，目的是建立全面覆蓋、秩序協(xié)調(diào)、標(biāo)準(zhǔn)化的綜合科學(xué)技術(shù)倫理治理體系。目前，國家衛(wèi)計委正在采取相應(yīng)的立法行動，并起草了《生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)臨床應(yīng)用管理條例》（征求意見稿）》和《生物技術(shù)研究開發(fā)安全管理條例（征求意見稿）》，目標(biāo)是形成更加合理的監(jiān)督機制，以便生物技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

由此，我國基本形成了與基因療法技術(shù)以及行業(yè)發(fā)展相適應(yīng)相協(xié)調(diào)的全面監(jiān)管政策。
近年來，我國基因療法領(lǐng)域正在逐步興起。作為一種新的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它正在深刻地改變著制藥業(yè)的面貌，但還并未發(fā)展成熟，對此人類還需要進行更長時間的探索和發(fā)現(xiàn)。

盡管如此，這并不可怕。“泡泡男孩”的基因療法事件告誡九游會j9，相比于恐懼，在學(xué)習(xí)中探索未知，才會使基因療法領(lǐng)域得到蓬勃發(fā)展，才能使得更多患者獲得生的希望。

因此，公眾對該領(lǐng)域的認(rèn)可、國家社會對該領(lǐng)域的支持、相關(guān)法律法規(guī)的建樹，都將會成為該領(lǐng)域新療法誕生的關(guān)鍵推力。

九游會j9生物將持續(xù)專注于基因治療CDMO服務(wù)，助力基因治療造福人類。基于公司基因和細(xì)胞治療載體CDMO平臺可提供從非注冊臨床研究用質(zhì)：筒《舊↖IT）、基因治療新藥臨床申報整體方案（IND）到基因治療臨床樣品及商業(yè)化GMP生產(chǎn)的整體服務(wù)，服務(wù)產(chǎn)品包括基因和細(xì)胞治療用質(zhì)粒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、腺病毒、多種溶瘤病毒以及基因疫苗等新型基因載體。

參考資料：
1.An overview of development in gene therapeutics in China

01 非注冊臨床研究用質(zhì)：筒《舊
   在符合GMP管理體系的中試車間完成質(zhì)：筒《舊⑻峁┧脅返鬧柿考煅楸ǜ，用于在醫(yī)院開展研究者發(fā)起的臨床研究。
02 基因治療新藥臨床申報整體方案
   提供可用于中、美新藥臨床試驗申請的臨床前中試樣品生產(chǎn)服務(wù)， 根據(jù)開發(fā)的實驗室規(guī)模工藝進行中試放大，生產(chǎn)過程嚴(yán)格按照GMP要求進行，中試樣品用于申報IND，并撰寫全套雙語CMC材料。中試過程由經(jīng)驗豐富的生物制藥工程師負(fù)責(zé)，并由實驗室工藝開發(fā)研究員負(fù)責(zé)技術(shù)轉(zhuǎn)移。

主要涉及：

• 工藝研究和質(zhì)量研究
• 連續(xù)批次中試生產(chǎn)和穩(wěn)定性研究
• 質(zhì)粒和病毒全套申報CMC材料

03 基因治療臨床樣品及商業(yè)化GMP生產(chǎn)
   GMP生產(chǎn)平臺用于生產(chǎn)臨床級的重組病毒藥物，總投資過億元人民幣。研發(fā)生產(chǎn)總面積約10000m2，包括動力中心、 潔凈工程、WFI系統(tǒng)、倉庫、質(zhì)粒生產(chǎn)車間、病毒生產(chǎn)車間、質(zhì)控實驗室、灌裝車間等。平臺采用一次性生產(chǎn)技術(shù)進行質(zhì)：筒《鏡納，由GE醫(yī)療提供靈活工廠（FlexFactoryTM），其余輔助設(shè)備均采用國際優(yōu)質(zhì)品牌。
   基于該平臺，九游會j9生物將為基因治療和細(xì)胞治療藥物研發(fā)企業(yè)提供高質(zhì)量的病毒載體CDMO服務(wù)：

• 原材料入庫檢驗及放行
• GMP原材料供應(yīng)商審計
• 技術(shù)轉(zhuǎn)移、工藝開發(fā)及放大
• 制劑、方法學(xué)開發(fā)及驗證
• 質(zhì)量保證體系全流程管理
• 10L、50L、100L一次性反應(yīng)器大腸桿菌發(fā)酵質(zhì)粒生產(chǎn)
• 100L、200L、500L一次性反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)
• GMP液體制劑灌裝
• 短期及長期穩(wěn)定性研究等

04 其他服務(wù)

• GMP液體制劑灌裝服務(wù)
• 動物藥效學(xué)研究
• 注射用水
• 質(zhì)量控制咨詢與檢測
• 臨床樣本檢測等