氧化應(yīng)激被認(rèn)為是內(nèi)皮/血管功能障礙的主要因素，這在許多心腦血管疾病中都有發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)缺氧處理的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和缺氧缺葡萄糖處理的腦切片模型中活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加了。此外，氧化應(yīng)激還與衰老相關(guān)的血管功能障礙有關(guān)。因此，減輕氧化應(yīng)激是改善血管功能進(jìn)而治療血管疾病的重要策略，尤其是老年人。
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過將血管緊張素II (Ang II)轉(zhuǎn)化為血管緊張素，參與血管功能的調(diào)節(jié)。ACE2/血管緊張素信號(hào)傳導(dǎo)可以預(yù)防血管功能障礙和氧化應(yīng)激。文獻(xiàn)中提出，ACE2過表達(dá)可減少小鼠的缺血性腦損傷，而ACE2缺乏會(huì)增加成年小鼠大腦動(dòng)脈的氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙。此外，文獻(xiàn)還發(fā)現(xiàn)ACE2對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）具有保護(hù)作用。在EPCs中過表達(dá)ACE2（ACE2-EPCs）可減少細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激和改善EPC功能。EPCs是骨髓來源的祖細(xì)胞，具有向ECs分化的能力，在維持內(nèi)皮功能和止血方面發(fā)揮重要作用。
外泌體是一種胞外囊泡，它們可通過遞送蛋白質(zhì)和microRNAs介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。近期文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞來源的胞外囊泡能傳遞其母細(xì)胞的特性，如來自健康對(duì)照組的EPCs來源的囊泡通過其攜帶的miR-126對(duì)糖尿病患者的EPCs功能具有保護(hù)作用。但是，ACE2-EPC-EXs在衰老過程中對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用仍然未知。
在本篇研究中，作者想觀察出相比年輕的ECs，ACE2-EPC-EXs是否通過miR-18a/Nox2/ROS途徑能更好地保護(hù)衰老ECs抵抗缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
九游會(huì)j9生物可提供從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體高通量檢測(cè)、外泌體示蹤到體內(nèi)外功能驗(yàn)證的整體服務(wù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.衰老ECs的特征
為了估算衰老的開始時(shí)間，作者用細(xì)胞衰老的標(biāo)志物SA-β-gal進(jìn)行染色觀察。結(jié)果顯示，與對(duì)照組ECs相比，用Ang II刺激的細(xì)胞其SA-β-gal染色明顯增加（Fig. 1A），表明了EC衰老模型的建立是成功的。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)在衰老ECs中p16水平顯著增加（Fig. 1B）。值得注意的是，在衰老的ECs中，ACE2和miR-18a的水平都下降了（Fig. 1D）。Ang II誘導(dǎo)EC衰老，引起ROS過量產(chǎn)生（Fig. 1C）和ECs的成管能力受損（Fig. 1E）。
Fig. 1 Ang II誘導(dǎo)的EC衰老模型特征
2.EPCs轉(zhuǎn)染ACE2后，使得ACE2-EPCs及其釋放的外泌體中ACE2和miR-18a水平升高
如Fig. 2A和B所示，與EPCs和EPC-EXs相比，ACE2-EPCs和它們釋放的外泌體中ACE2的的mRNA水平顯示是上調(diào)的，這表明ACE2-EPC-EXs成功產(chǎn)生了。同時(shí)，miR-18a水平在ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中也是增加的，這說明了miR-18a在ACE2-EPC-EXs中的潛在作用。在ACE2-EPCs中使用miR-18a抑制劑來敲低miR-18a水平并不會(huì)改變ACE2的表達(dá)，但會(huì)下調(diào)ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中miR-18a的水平。ACE2抑制劑DX600可抑制ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中ACE2誘導(dǎo)的miR-18a升高。
根據(jù)NTA結(jié)果（Fig. 2C），四種類型的EXs在大小和濃度上沒有顯著差異，說明轉(zhuǎn)染miR-18a抑制劑并沒有改變ACE2-EPCs釋放的外泌體。
Fig. 2 分析ACE2-EPCs及其釋放的EXs中ACE2和miR-18a的水平，并評(píng)估EX的大小和濃度
3.ACE2-EPC-EX與ECs共培養(yǎng)會(huì)使ECs中ACE2和miR-18a水平增加
如Fig. 3A所示，用PKH26標(biāo)記的EXs在年輕和衰老的ECs細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，表明年輕和衰老的ECs都可以吸收EXs。為了闡明ACE2-EPC-EXs是否能將其攜帶的ACE2和miR-18a傳遞給ECs，作者用qRT-PCR檢測(cè)與三種不同類型的EPC-EXs共培養(yǎng)后的年輕和衰老ECs中ACE2和miR-18a水平。作者數(shù)據(jù)（Fig. 3B）顯示，與空載的vehicle和EPC-EXs共培養(yǎng)后的ECs中ACE2的mRNA水平?jīng)]有差異。然而，與ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)后能顯著提高ACE2水平，且在衰老的ECs中水平更高。在ECs中，ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)比EPC-EXs更有效地提高了miR-18a水平，而在衰老的ECs中則更高。此外，ECs與ACE2-EPC-EXs+DX600或ACE2-EPC-EXsanti-miR-18a共培養(yǎng)后，其miR-18a水平下調(diào)，但是ACE2表達(dá)則沒有變化（Fig. 3C）。
Fig. 3 ACE2-EPC-EXs與H/R損傷的ECs結(jié)合，改變了ECs中的ACE2和miR-18a水平
4.ACE2-EPC-Exs在減少ECs中H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和功能障礙方面比EPC-EXs更有效，對(duì)衰老的ECs效果更好
為了確定ACE2-EPC-EXs是否能保護(hù)ECs免受H/R損傷，作者將不同類型的EPC-EXs分別與年輕的和衰老的ECs共培養(yǎng)來評(píng)估其凋亡率。如Fig. 4A所示，H/R誘導(dǎo)的衰老ECs的凋亡率高于年輕ECs。與未載EX的vehicle（H/R條件下培養(yǎng)）相比，EPC-EXs共培養(yǎng)顯著降低了年輕和衰老ECs的凋亡。ACE2-EPC-EXs在降低H/R誘導(dǎo)的EC凋亡方面比EPC-EXs更有效。更重要的是，ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)會(huì)使年輕ECs的H/R誘導(dǎo)的凋亡率從30%降低到9%左右，使衰老ECs的H/R誘導(dǎo)的凋亡率從68%降低到17%左右，這個(gè)數(shù)據(jù)說明ACE2-EPC-EXs對(duì)衰老ECs的抗凋亡作用比年輕ECs效果更好。同時(shí)，作者也發(fā)現(xiàn)敲低miR-18a能部分抑制ACE2-EPC-EXs的抗凋亡作用。與ACE2-EPC-EXs+DX600共培養(yǎng)的ECs也有類似的作用。
如Fig. 4B所示，血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H/R可降低年輕和衰老ECs的成管能力，而EPC-EXs可改善這一情況。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs更能有效地改善H/R誘導(dǎo)的EC成管能力損傷。此外，ACE2-EPC-EXs顯著提高了ECs的成管能力，年輕的ECs約140%，衰老的ECs約150%。ACE2-EPC-EXs+DX600和ACE2-EPC-EXs anti-miR-18a?會(huì)部分降低了ACE2-EPC-EXs的促血管生成作用，這說明了miR-18a參與了ACE2-EPC-EXs的促血管生成作用。
Fig. 4 ACE2-EPC-EXs在H/R損傷的年輕和衰老的ECs中能更好的減少細(xì)胞凋亡和改善ECs功能的作用，尤其在衰老的ECs中具有更明顯的效果
5.ACE2-EPC-EXs在降低ECs中H/R誘導(dǎo)引起的ROS過量產(chǎn)生和Nox2表達(dá)方面比EPC-EXs更有效，對(duì)衰老的ECs有更好的作用
為了確定ACE2-EPC-EXs是否可以通過減弱氧化應(yīng)激來保護(hù)ECs免受H/R損傷，作者分析了與不同類型的EPC-EXs共培養(yǎng)后年輕的和衰老的ECs的ROS產(chǎn)生情況。如Fig. 5A所示，H/R誘導(dǎo)的ROS水平在衰老的ECs中比在年輕的ECs中要高。EPC-EXs共培養(yǎng)能降低年輕的和衰老ECs中ROS的過量產(chǎn)生。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs更有效地減少H/R誘導(dǎo)的ROS過量產(chǎn)生。更重要的是，ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)可減少H/R誘導(dǎo)的ROS過量產(chǎn)生，其中在年輕的ECs中減少約38%，在衰老的ECs找那個(gè)減少約55%，這表明了相比年輕的ECs，ACE2-EPC-EXs對(duì)衰老的ECs有更好的抗氧化作用。敲低miR-18a能部分阻斷兩種ECs中ACE2-EPC-EXs的抗氧化作用，對(duì)衰老ECs的抑制作用更強(qiáng)，這提示了miR-18a可能在ACE2-EPC-EXs的抗氧化作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
Fig. 5 ACE2-EPC-EXs在降低年輕和衰老的ECs中由H/R誘導(dǎo)的ROS過量產(chǎn)生和增加NO下調(diào)方面具有更好的作用，尤其在衰老的ECs中效果更好
6.ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs在提高H/R誘導(dǎo)的ECs中NO生成和eNOS表達(dá)下降方面更有效，對(duì)衰老的ECs有更好的作用
作者也分析了與不同類型EPC-EXs共培養(yǎng)后年輕和衰老的ECs中CO產(chǎn)生和eNOS水平的情況。如Fig. 5B所示，與年輕的ECs相比，H/R降低了衰老ECs的CO水平。EPC-EXs共培養(yǎng)增加了年輕和衰老ECs中NO的產(chǎn)生。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs能更有效地增加NO的產(chǎn)生。此外，ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)可提高年輕ECs中NO的產(chǎn)生約81%，而衰老ECs中提高約91%，這也說明了與年輕ECs相比，ACE2-EPC-EXs對(duì)衰老ECs顯示出更好的作用。敲低miR-18a在兩種類型ECs中都部分阻斷了ACE2-EPC-EXs的這種作用，對(duì)衰老ECs有更強(qiáng)的抑制作用。
如Fig.6B所示，與年輕的ECs相比，H/R降低了衰老ECs中的eNOS水平。EPC-EXs共培養(yǎng)能顯著增加年輕和衰老ECs中的eNOS水平。ACE2-EPC-EXs共培養(yǎng)可使年輕ECs的eNOS水平提高約143%，使衰老ECs的eNOS水平提高約166%，這表明與年輕ECs增加的eNOS水平相比，ACE2-EPC-EXs對(duì)衰老ECs中eNOS水平提高具有更好的作用。類似地，敲低miR-18a能部分阻斷這種效應(yīng)?？傊?，ACE2-EPC-EXs可以通過miR-18a/eNOS/NO通路改善H/R誘導(dǎo)的EC功能。
Fig. 6 在H/R條件下，ACE2-EPC-EXs能較好地降低年輕和衰老ECs的Nox2水平和增加eNOS水平，對(duì)衰老ECs有較好的療效
文章結(jié)論：
在受到H/R損傷條件下，ACE2-EPC-EXs表現(xiàn)出對(duì)衰老的ECs比年輕的ECs有更強(qiáng)的抗氧化和抗凋亡作用，主要是通過其攜帶的miR-18a并隨后下調(diào)Nox2/ROS途徑實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還可以用于檢測(cè)ACE2-EPC-EXs在體內(nèi)的保護(hù)作用，并確定miR-18a的靶標(biāo)。這些方法可能極大地提高九游會(huì)j9對(duì)ACE2介導(dǎo)的缺血性腦卒中保護(hù)的分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，并可能為開發(fā)新的治療方法提供參考依據(jù)。
九游會(huì)j9生物一直致力為外泌體研究提供整體解決方案，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測(cè)到外泌體示蹤和體內(nèi)外功能驗(yàn)證，豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)、專業(yè)的科研團(tuán)隊(duì)、優(yōu)質(zhì)的技術(shù)支持服務(wù)，為您的項(xiàng)目保駕護(hù)航！
參考文獻(xiàn):：
1. ACE2-EPC-EXs protect ageing ECs against hypoxia/reoxygenation-induced injury through the miR-18a/Nox2/ROS pathway. J Cell Mol Med. 2018; 22:1873-1882.
2. Drexler H. Endothelial dysfunction: clinical implications. Prog Cardiovasc Dis. 1997;39:287–324.
3. Ohara Y, Peterson TE, Harrison DG. Hypercholesterolemia increases endothelial superoxide anion production. J Clin Invest. 1993;91:2546–51.
4. Keaney JF Jr, Vita JA. Atherosclerosis, oxidative stress, and antioxidant protection in endothelium-derived relaxing factor action. Prog Cardiovasc Dis. 1995; 38:129–54.
5. Cai H, Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the role of oxidant stress. Circ Res. 2000; 87:840–4.
6. Wang J, Chen S, Ma X, et al. Effects of endothelial progenitor cell-derived microvesicles on hypoxia/reoxygenation-induced endothelial dysfunction and apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2013; 2013: 572729.
7. Zheng JL, Li GZ, Chen SZ, et al. Angiotensin converting enzyme 2/Ang-(1-7)/mas axis protects brain from ischemic injury with a tendency of age-dependence. CNS Neurosci Ther. 2014; 20: 452–9.
8. Dikalov S. Cross talk between mitochondria and NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 2011; 51: 1289–301.
9. Pena Silva RA, Chu Y, Miller JD, et al. Impact of ACE2 deficiency and oxidative stress on cerebrovascular function with aging. Stroke. 2012; 43: 3358–63.
