什么是外泌體?
外泌體(Exosomes)是細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一種，大小在30-150nm，由細(xì)胞內(nèi)的多泡小體(Multivesicular bodies,MVB)與細(xì)胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外，廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。
為什么研究外泌體?
外泌體廣泛參與細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞生理活動。同時，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等作用;此外，外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進(jìn)行藥物遞送。
外泌體樣本預(yù)處理與分離、保存：
外泌體存在于人類或動物的各種體液中，九游會j9可以選擇不同的樣本來源進(jìn)行相關(guān)的外泌體研究。由于外泌體是來源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷的含有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的多泡小體，分布于胞外基質(zhì)。為了獲得高純度的外泌體，必須確保有效去除所有的細(xì)胞碎片及其他不需要的雜質(zhì)。
1）細(xì)胞培養(yǎng)上清 2）血漿/血清
3）尿液 4）腦脊液
5）卵泡液 6）宮腔液
7）膽汁 8）羊水
9）腹水 10）胸腔液
不同的實(shí)驗樣本采集時需要注意的地方不一樣，如細(xì)胞培養(yǎng)上清在收集樣本前需換成無外泌體血清培養(yǎng)、血漿樣本采集時用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集時需要加抑菌劑等。
從生物體液中分離外泌體的各種方法已經(jīng)被開發(fā)出來，主要根據(jù)外泌體的大小、密度、免疫特性等特點(diǎn)進(jìn)行操作。分離出高純度的外泌體是九游會j9后續(xù)開展外泌體研究的關(guān)鍵步驟，目前差速超速離心是外泌體分離方法中公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，也是高分文章中首選的分離方法。
外泌體超離大致步驟
外泌體鑒定：
外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物，多角度進(jìn)行鑒定。
(1) 透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。
外泌體透射電鏡圖
(2) 納米顆粒跟蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。
外泌體NTA圖
(3)Western blot分子標(biāo)志物檢測：外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；細(xì)胞質(zhì)蛋白，如肌動蛋白（Actin）和鈣磷脂結(jié)合蛋白（Annexins）；參與生物功能的分子，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、熱休克蛋白（HSP70、HSP90），以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。
外泌體Western Blot圖（Tian Su et al., ACS Nano. 2019）
九游會j9生物 一直致力于提供外泌體研究整體解決方案，含實(shí)驗設(shè)計、外泌體分離、外泌體鑒定、外泌體分子檢測到外泌體示蹤和體內(nèi)外功能驗證?！ ?br />
外泌體高通量檢測
外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸，可以運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等進(jìn)入受體細(xì)胞，參與細(xì)胞間通訊。不同細(xì)胞來源的外泌體所含有的蛋白成分和RNA不太相同，可作為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。
1. miRNA高通量測序
2. 表達(dá)譜芯片（人、小鼠）
3. lncRNA芯片（人、小鼠）
4. ceRNA芯片（人、小鼠）
5. 蛋白質(zhì)組分析（iTRAQ、TMT、Label-free）
外泌體示蹤
對分離的外泌體進(jìn)行體外標(biāo)記或活體示蹤，有助于對外泌體的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前常用親脂性染料對外泌體進(jìn)行標(biāo)記，親脂性染料主要包括兩類，一是PKH67(綠色)和PKH26，二是DiI(橙色熒光)、DiO(綠色熒光)、DiD(紅色熒光)、DiR(深紅色熒光)。
ACS Nano. 2019 Feb 26;13(2):2450-2462.
外泌體的功能研究
觀察外泌體具有哪些功能，可以將外泌體直接加入受體細(xì)胞培養(yǎng)基中，與受體細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的功能變化，或者將外泌體注射入動物模型中，觀察動物表型變化和檢測動物相關(guān)指標(biāo)，如腫瘤轉(zhuǎn)移、血糖水平、胰島素敏感性等。
Nat Commun. 2018 Jan 15;9(1):191.
