【WHO慢病毒整合拷貝數(shù)標準品】之標定方法解讀篇
?喜報！九游會j9生物 作為國內領先的基因治療病毒載體CDMO企業(yè)，參與世界衛(wèi)生組織（WHO）牽頭的、全球首個基于基因治療用慢病毒的標準品標定項目，并順利完成任務，為全球基因和細胞治療的發(fā)展貢獻自己的核心力量！
近年來，隨著Kymriah, Yescarta 以及 Strimvelis等細胞治療產品陸續(xù)推上市。慢病毒作為細胞裝載CAR過程的關鍵中間載體，其整合拷貝數(shù)測定標準的確立更是亟待解決的關鍵問題。
目前，慢病毒整合拷貝數(shù)測定方法主要是定量PCR，該方法由于受標準品的選擇、引物序列的選擇以及反應條件等影響，導致不同實驗室之間檢測方法及檢測靈敏度存在巨大差異，這使其在臨床試驗、檢測以及不同實驗室之間的數(shù)據難以進行比較。
WHO-CS633項目是由WHO及英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）發(fā)起，通過在全球范圍內不同實驗室對慢病毒感染后的HEK293T細胞基因組DNA進行拷貝數(shù)標定，進而確定慢病毒整合拷貝數(shù)國際標準品。該項目主要采用TaqMan qPCR，SYBRGreen qPCR及ddPCR（digital PCR）三種方法對5份凍干基因組DNA進行拷貝數(shù)的檢測。
5種基因組DNA樣品編號分別為A/E（A和E是相同的樣品）、B、C和D，包含0、低、中或高不同拷貝數(shù)，按下表（Table 1）說明進行制備后，使用qPCR對A/E、B、C、C1、C2、C3、C4和D 8個樣品及ddPCR對 A/E、B、C和D 4個樣品進行測試。其中qPCR方法采用同一個已知拷貝數(shù)的DNA標準品“NIBSC DNA standard”進行梯度稀釋制備慢病毒基因與內參基因（housekeeping，HK）標準曲線，從而計算慢病毒基因拷貝數(shù)與內參基因拷貝數(shù)。
每種方法由不同的操作員分別于3天進行3次獨立的實驗，收集各實驗室樣品的原始數(shù)據和定量結果（例如qPCR Ct值或ddPCR液滴計數(shù)）進行分析。
此次標定主要基于TaqMan qPCR、SYBRGreen qPCR和ddPCR 3種方法，共篩選收集了全球13個國家/地區(qū)的31個實驗室的檢測結果。
其中，29個實驗室采用TaqMan qPCR、13個實驗室采用SYBRGreen qPCR、11個實驗室采用ddPCR方法來評估慢病毒整合拷貝數(shù)（所有研究均使用參與標定實驗室的試劑和設備進行），最終獲得 60 組慢病毒基因組拷貝數(shù)檢測結果（包括 31 組TaqMan qPCR、15 組SYBRGreen qPCR和14組dd PCR數(shù)據），共計66名實驗人員參與到此次標定工作。
對來自不同實驗室的38組qPCR和14組ddPCR的有效數(shù)據進行分析，結果表明各實驗室間qPCR 測定 （n=38）的 GCV 值在14.9%-20.2%之間，樣品B、C、D的LV copies/cell平均值分別為1.42（1.37 - 1.48）、8.76 （8.26 - 9.29）和10.67（10.05 -11.33），TaqMan qPCR與SYBRGreen qPCR結果相對一致，而兩種ddPCR（simplex ddPCR和multiplex ddPCR）之間存在差異（Table 2 和Figure 1）。
用梯度稀釋的樣品C作為標曲，對未知樣品B和D進行計算。相較質粒標準品，樣品B和D qPCR結果的GCV值降低（樣品B的GCV值從15.7%降至11.5%，樣品D從19.5%降至16.2%）；而對于ddPCR結果，樣品D的GCV值從25.9%降至4.8%，但樣品B的GCV值從12.1%增加到25.2%。
從qPCR和ddPCR（Multiplex）綜合分析，樣品B和樣品D的GCV值均存在降低（Table 3和Figure 1）。
此外，本項目對樣品B、C和D進行測序及含量測定（Nanodrop和QuBit），這對分析慢病毒的整合位點和基因組DNA定量提供了支持。
整合分析來自全球31個不同實驗室的數(shù)據，整體研究數(shù)據質量較高（qPCR：38次有效數(shù)據/ 46次檢測實驗，ddPCR：所有數(shù)據均有效），qPCR檢測的單細胞慢病毒拷貝數(shù)有效數(shù)據在各實驗室間的GCV波動范圍較。鴇dPCR數(shù)據之間以及與qPCR數(shù)據對比存在差異。
利用梯度稀釋的樣品C作為標曲，對未知樣品B和D進行計算。相較于質粒標準品，樣品B和D在實驗室間變異性減。適褂醚綜（基因組DNA）作為慢病毒整合拷貝數(shù)國際標準品，減少了不同實驗室使用質粒DNA標準品存在的潛在差異，可實現(xiàn)慢病毒整合拷貝數(shù)檢測在臨床試驗、檢測以及實驗室之間的標準化。
同時，該項目對用于慢病毒整合拷貝數(shù)國際標準品基因組DNA的制劑處方進行了篩。⒖疾熗8個月以上的穩(wěn)定性。研究表明，基因組DNA在經過長期（-20℃條件下）、高溫（56℃）、凍融操作后，其慢病毒整合拷貝數(shù)沒有顯著變化，表明該基因組DNA制劑可以在-20°C條件下長期儲存并保持穩(wěn)定。
九游會j9生物 有幸作為國內基因治療病毒載體CDMO企業(yè)參與到該項慢病毒標準品標定工作中，為推動慢病毒在臨床試驗、檢測以及不同實驗室之間的數(shù)據傳遞與共享貢獻力量。
不僅從中獲取經驗、展現(xiàn)中國力量，九游會j9生物 也同時為廣大基因治療研發(fā)企業(yè)帶來全球化視角和國際病毒生產標準，真正推動基因療法上市應用。
