時間：2019-11-13 熱度：

光遺傳學技術是在動物模型中深入理解神經(jīng)環(huán)路系統(tǒng)的有力工具，由斯坦福大學科學家Karl Deisseroth發(fā)明。從誕生以來，光遺傳學廣泛應用于各大神經(jīng)科學領域，現(xiàn)已成為神經(jīng)科學領域中最重要的技術手段之一。據(jù)其相關文獻發(fā)表數(shù)量九游會j9便可略知一二[1]。

截至2015年，光遺傳學及視蛋白相關文獻發(fā)表數(shù)量圖片來源：Nature Neuroscience[1]

光遺傳學技術對神經(jīng)元活性的操控依賴于光敏感通道蛋白（Channelrhodopsins, ChRs）,在神經(jīng)元中表達ChRs可以實現(xiàn)光控神經(jīng)元激活或光控神經(jīng)元抑制效應，這些ChRs已廣泛應用于神經(jīng)科學研究[2, 3]。

幾種不同功能的ChRs

圖片來源：Molecular Genetics and Genomics[4]

但是，現(xiàn)階段常用的ChRs并非完美無瑕，它們的缺陷限制了光遺傳學技術的應用廣度。首先，在可見光范圍內(nèi)，這些ChRs具有廣泛的激活光譜，即激活ChRs的可見光缺乏波長特異性。其次，ChRs需要足夠強（約1 mW/mm²）的光照方可激活。引起一個神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，需要同時激活10⁵-10⁶個ChRs[5]。再次，不同ChRs的激活延遲時間不同，九游會j9需要優(yōu)化ChRs的動力學特性。最后，光遺傳學技術需要植入光纖，會引起組織損傷。

激活幾類ChRs的光譜 圖片來源：Molecular Genetics and Genomics[4] 因此，改造ChRs以擴寬其應用范圍十分重要，但是以現(xiàn)有的技術實現(xiàn)這一目標存在以下三個挑戰(zhàn)。其一，ChRs是跨膜蛋白，有關蛋白表達與質膜定位的相關氨基酸序列十分難以捉摸[6]。其二，檢測ChRs性質的生物學技術（如膜片鉗電生理技術）通量較低，難以勝任定向進化的高通量篩選過程[7]。其三，在體應用需要多種性質的保留與優(yōu)化。這些改造的ChRs需要同時具有質膜定位能力與更佳的功能性質。

圖片來源：Tutorials point 目前，多種多樣的ChRs已被發(fā)表于各類期刊中。其中，有些是自然界中發(fā)現(xiàn)的ChRs，有些是通過重組改造而成的ChRs，有些是致突變作用產(chǎn)生的ChRs，還有些是直接設計而成的ChRs。這些研究在一定程度上理解了ChRs的結構與功能之間的關系。但是，若要通過非特殊序列預測ChRs的功能性質，目前的研究只能望塵莫及。

圖片來源：Entrepreneur

2019年10月14日，《Nature Methods》雜志在線刊登了加州理工學院Frances H. Arnold研究組的最新重要工作[8]，他們通過高斯過程篩選出3種高性能ChRs——ChRger1-3，其中ChRger2可實現(xiàn)無創(chuàng)光操控神經(jīng)元這一過程。該研究將機器學習應用于分子篩選過程，拓寬了光遺傳學的應用廣度，極大促進了神經(jīng)科學領域的研究進展。

2018年諾貝爾化學獎得主Frances H. Arnold

圖片來源：Princeton University

結果

1.機器學習引導ChRs的優(yōu)化過程

首先，為優(yōu)化ChRs的光電流強度、波長特異性和動力學特性，作者通過高斯過程分類與高斯過程回歸模型，在120000種理論上存在的ChRs中篩選出上述三類特性俱佳的28種ChRs（圖1a-d）。然后，作者將這28種ChRs表達于HEK細胞并通過膜片鉗電生理手段檢驗其性質是否符合預期。他們發(fā)現(xiàn)，這些ChRs的性質均與高斯過程預測的性質高度一致（圖1e-f），表明此機器學習方法可應用于ChRs的優(yōu)化過程。

圖1  機器學習引導ChRs的優(yōu)化過程

2.機器學習預測的ChRs具有優(yōu)異的功能特性

接著，作者進一步檢驗上述28種ChRs的性質。他們將這些ChRs表達于HEK細胞，并使用膜片鉗電生理技術記錄這些細胞。他們發(fā)現(xiàn)，其中12種ChRs具有極高的光電流強度，2種ChRs具有極短的（~12 ms）激活延遲時間，4種ChRs具有極長的（~17 s）激活延遲時間，1種ChR的激活光譜比較狹窄（圖2）。這些ChRs在這幾方面的性質顯著優(yōu)于現(xiàn)存的所有ChRs，其中ChR_9_4、ChR_25_9和ChR_11_10的電導率最高。作者將其重新命名為ChRger1、ChRger2和ChRger3，并對這三種ChR在神經(jīng)元中的功能特性展開進一步探究。

圖2  機器學習預測的ChRs具有優(yōu)異的功能特性

3.ChRger1-3功能特性的在體驗證

在神經(jīng)科學領域的研究中，ChRs需要在神經(jīng)元中行使其功能。為進一步探究ChRger1-3在神經(jīng)元中的功能特性，作者通過AAV將其表達于培養(yǎng)的神經(jīng)元（圖3a），并使用膜片鉗電生理技術記錄這些神經(jīng)元。他們發(fā)現(xiàn)，與CoChR和ChR2相比，ChRger1-3在更低的光強條件下即可介導神經(jīng)元的激活過程（圖3b-f）。

然后，作者在體驗證ChRger1-3在神經(jīng)元中的功能特性。他們在小鼠前額葉皮層中注射rAAV-PHP.eB[9]以實現(xiàn)ChRger1-3或ChR2在神經(jīng)元中的表達，并使用膜片鉗電生理技術記錄這些ChRs陽性神經(jīng)元。他們發(fā)現(xiàn)，激活ChRger1-3需要的光照強度更低，且同等光照強度條件下，ChRger1-3介導的光電流強度更高（圖3g-h），表明ChRger1-3的光敏感度顯著高于ChR2。 再然后，作者探究ChRger1-3能否在系統(tǒng)表達的條件下行使其功能。他們在小鼠中靜脈注射rAAV-PHP.eB以實現(xiàn)ChRger1-3或ChR2的系統(tǒng)表達，并使用膜片鉗電生理技術記錄這些ChRs陽性神經(jīng)元。他們發(fā)現(xiàn)在光照條件下，幾乎所有ChRger1-3陽性神經(jīng)元均會發(fā)放，而只有4%的ChR2陽性神經(jīng)元發(fā)放（圖3i-l）。此外，在高頻光照條件下，ChRger2表現(xiàn)最佳（圖3m-n），于是作者關于ChRger2的應用廣度展開進一步探究。

圖3  ChRger1-3功能特性的在體驗證

4. ChRger2介導無創(chuàng)光控神經(jīng)元過程

為進一步探究ChRger2在系統(tǒng)表達的條件下的功能，他們在Dat-Cre小鼠中靜脈注射rAAV-PHP.eB包被的AAV-DIO-ChRger2或AAV-DIO-ChR2并植入光纖。他們發(fā)現(xiàn)光激活ChRger2陽性神經(jīng)元誘發(fā)小鼠產(chǎn)生大量獎賞行為，而光激活ChR2無任何影響（圖4a-c）,表明在系統(tǒng)給藥條件下，ChRger2可介導足夠強的光電流以誘發(fā)相應功能，而ChR2不能。

最后，作者探究ChRger2在無創(chuàng)光控神經(jīng)元過程中的應用。他們在小鼠中靜脈注射rAAV-PHP.eB包被的AAV-hSyn-ChRger2，在第二運動皮層上方顱骨表面放置光纖。他們發(fā)現(xiàn)447 nm藍色激光誘發(fā)小鼠產(chǎn)生偏轉運動，而671 nm紅色激光不能（圖4d-g）,表明ChRger2可充分介導無創(chuàng)光控神經(jīng)元過程。

圖4 ChRger2介導無創(chuàng)光控神經(jīng)元過程 總結 光遺傳學技術是神經(jīng)科學領域中的有力工具，應用甚廣。但是，承載這項技術的ChRs具有光敏感度低、光電流強度低等特點，且現(xiàn)階段常用的光操控神經(jīng)元手段會造成腦組織損傷，這些缺陷阻礙了光遺傳學技術的進一步發(fā)展。此外，檢測ChRs性質的神經(jīng)科學技術通量較低，難以實現(xiàn)大批量篩選過程。本篇文章將人工智能與神經(jīng)科學相結合，通過高斯過程、膜片鉗電生理、病毒注射等方法，開發(fā)了幾種新型ChRs——ChRger1-3。這些新型的ChRs具有極佳的功能特性，可以實現(xiàn)系統(tǒng)表達，其中ChRger2可充分介導無創(chuàng)光控神經(jīng)元過程。這項研究極大擴寬了光遺傳學的應用廣度，也為神經(jīng)科學研究提供了新型方案，人工智能必將在更多領域發(fā)光發(fā)熱！

 

參考文獻
1.Deisseroth, K., Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience, 2015. 18: p. 1213.
2.Deisseroth, K. and P. Hegemann, The form and function of channelrhodopsin. Science, 2017. 357(6356).
3.Yizhar, O., et al., Optogenetics in neural systems. Neuron, 2011. 71(1): p. 9-34.
4.Rein, M.L. and J.M. Deussing, The optogenetic (r)evolution. Mol Genet Genomics, 2012. 287(2): p. 95-109.
5.Lin, J.Y., A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol, 2011. 96(1): p. 19-25.
6.Bedbrook, C.N., et al., Machine learning to design integral membrane channelrhodopsins for efficient eukaryotic expression and plasma membrane localization. PLoS Comput Biol, 2017. 13(10): p. e1005786.
7.Romero, P.A. and F.H. Arnold, Exploring protein fitness landscapes by directed evolution. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009. 10(12): p. 866-76.
8.Bedbrook, C.N., et al., Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nat Methods, 2019.
9.Chan, K.Y., et al., Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci, 2017. 20(8): p. 1172-1179.