時(shí)間：2018-05-14 熱度：

在每個(gè)人的大腦深處，都有一段不可磨滅的記憶，或歡喜快樂，或悲傷哀愁。記憶是人腦對(duì)經(jīng)歷過事物的識(shí)記、保持、再現(xiàn)或再認(rèn)，它是進(jìn)行思維、想象等高級(jí)心理活動(dòng)的基礎(chǔ)。那么，記憶存儲(chǔ)于何處？

在大腦中，有一類神經(jīng)細(xì)胞在九游會(huì)j9形成記憶時(shí)被激活，它們被稱為記憶的印跡細(xì)胞（Engram cells）。大量研究已證實(shí)，印跡細(xì)胞存在于海馬、內(nèi)嗅皮層等多個(gè)腦區(qū)中，當(dāng)九游會(huì)j9貯存、提取記憶時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)被激活。

關(guān)于記憶印跡的形成，Hebb有這樣一種假說，“Neurons that Fire Together, Wire Together…”，即兩個(gè)神經(jīng)元一起放電的時(shí)候，他們之間的突觸連接會(huì)逐步建立或增強(qiáng)。然而，過去的技術(shù)手段無法幫助九游會(huì)j9找尋記憶相關(guān)的突觸位置，因此九游會(huì)j9難以研究伴隨記憶的形成，發(fā)生變化的突觸是否是記憶相關(guān)的突觸。

為實(shí)現(xiàn)上述構(gòu)想，九游會(huì)j9需要標(biāo)記特定兩個(gè)細(xì)胞之間的突觸。過去的研究曾使用綠色熒光蛋白突觸重構(gòu)（Green Fluorescent Protein Reconstitution Across Synaptic Partners， GRASP）技術(shù)[1]。這項(xiàng)技術(shù)將綠色熒光蛋白的兩個(gè)片段分別表達(dá)在突觸前或突觸后的膜表面，因此綠色熒光蛋白只表達(dá)在突觸位置。那么，GRASP能否用于上述記憶存儲(chǔ)的突觸機(jī)制研究呢？

GRASP技術(shù)

2018年4月27日，《Science》雜志刊登了韓國首爾國立大學(xué)Bong-Kiun Kaang教授的最新重要工作[2]，他們開發(fā)了強(qiáng)化版雙GRASP技術(shù)（dual-eGRASP）。他們通過使用攜帶不同熒光蛋白的AAV病毒標(biāo)記印跡細(xì)胞和非印跡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)記憶形成后，海馬CA3印跡細(xì)胞到CA1印跡細(xì)胞的突觸連接顯著增強(qiáng)。

本篇工作首次區(qū)分標(biāo)記突觸前的印跡細(xì)胞與非印跡細(xì)胞，表明難忘記憶的形成并非因?yàn)檎心剂烁嗟挠≯E細(xì)胞，而是由印跡細(xì)胞之間的突觸連接的強(qiáng)化所致。

Bong-Kiun Kaang教授

Result:

1、Dual-eGRASP技術(shù)區(qū)分單一神經(jīng)元表面不同來源的突觸

首先，為實(shí)現(xiàn)dual-eGRASP標(biāo)記，作者在突觸前表達(dá)青色pre-eGRASP或黃色pre-eGRASP，它們本身不會(huì)發(fā)出熒光，但如果它們與表達(dá)post-eGRASP的神經(jīng)元形成突觸，則會(huì)表達(dá)出青色或黃色熒光（圖1A），從而能夠做到標(biāo)記同一個(gè)神經(jīng)元上來源不同的突觸。為驗(yàn)證這項(xiàng)技術(shù)，作者在HEK293T細(xì)胞（圖1B-C）和內(nèi)嗅皮層-海馬DG區(qū)的通路（圖1D-E）中測(cè)試，均成功驗(yàn)證該項(xiàng)技術(shù)的效率。有趣的是，對(duì)CA1而言，同側(cè)CA3與對(duì)側(cè)CA3神經(jīng)元投射到相同區(qū)域，因此青色、黃色熒光蛋白表達(dá)在相同位置（圖1D-E）。

 
圖1 Dual-eGRASP技術(shù)區(qū)分同個(gè)神經(jīng)元不同來源的突觸

2、記憶形成后CA3與CA1印跡細(xì)胞之間的投射強(qiáng)度更高

結(jié)合Fos-TRE系統(tǒng)[3]，作者使用上述dual-eGRASP技術(shù)研究記憶存儲(chǔ)的突觸位置。他們?cè)趯?duì)側(cè)CA3注射AAV-c-Fos-rtTA3G和AAV-TRE3G-黃色pre-eGRASP，因?yàn)橹挥斜患せ畹纳窠?jīng)元可以啟動(dòng)c-Fos元件，因此只有CA3印跡細(xì)胞（E）可表達(dá)黃色pre-eGRASP；他們?cè)谕瑐?cè)CA3中注射少量AAV-Cre和大量AAV-DIO-青色pre-eGRASP，以隨機(jī)標(biāo)記CA3神經(jīng)元，軸突末端表達(dá)青色不表達(dá)黃色熒光的即非印跡細(xì)胞（N）。又用Fos-TRE系統(tǒng)與紅色熒光蛋白標(biāo)記同側(cè)CA1印跡細(xì)胞（E），用少量AAV-Cre和大量AAV-DIO-紫色熒光蛋白隨機(jī)標(biāo)記CA1神經(jīng)元，CA1紫色非紅色神經(jīng)元即非印跡細(xì)胞（N）（圖2A-B）。

通過觀察，他們驚喜地發(fā)現(xiàn)，小鼠在場(chǎng)景條件恐懼實(shí)驗(yàn)之后，其CA3到CA1的E-E突觸密度顯著增加，樹突棘數(shù)量增加，體積更大。而N-N、E-N、N-E之間的突觸無明顯變化（圖2C-E）。

圖2 記憶形成后CA3印跡細(xì)胞投射到CA1印跡細(xì)胞的強(qiáng)度更高

3、印跡細(xì)胞之間的突觸連接強(qiáng)度與記憶強(qiáng)度呈正相關(guān)

過去的研究表明，在不同的記憶強(qiáng)度之下，印跡細(xì)胞的數(shù)量維持不變。作者推測(cè)印跡細(xì)胞之間的突觸連接強(qiáng)度可以編碼記憶強(qiáng)度。為驗(yàn)證此推測(cè)，他們使用圖2A相同的方法，標(biāo)記CA1、CA3的印跡細(xì)胞（E）與非印跡細(xì)胞（N）。場(chǎng)景條件恐懼實(shí)驗(yàn)中，他們將小鼠分為3組，接受高強(qiáng)度足底電極、低強(qiáng)度足底電極或不接受足底電極，以代表3種記憶強(qiáng)度（圖3A-B）。發(fā)現(xiàn)隨著足底電極強(qiáng)度的提高，小鼠顫栗行為增加。此外，高強(qiáng)度足底電極條件下，E-E突觸強(qiáng)度顯著高于其他條件，而N-N、E-N、N-E之間的突觸強(qiáng)度不受足底電極影響（圖3C-F）。

圖3 印跡細(xì)胞之間的突觸連接強(qiáng)度與記憶強(qiáng)度呈正相關(guān)

4、記憶形成后CA3與CA1印跡細(xì)胞之間的突觸傳遞效率更高

在圖2的結(jié)果中，作者從形態(tài)學(xué)方面說明了記憶形成后CA3與CA1印跡細(xì)胞之間的投射強(qiáng)度更高，接下來，作者使用膜片鉗電生理方法進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。

他們使用Fos-rtTA系統(tǒng)配合AAV-TRE3G-ChrimsonR病毒標(biāo)記CA3印跡細(xì)胞（E），用AAV-CaMKIIα-Chronos標(biāo)記CA3全部興奮性神經(jīng)元（T）。又用Fos-rtTA配合AAV-TRE3G-mEmerald病毒標(biāo)記CA1印跡細(xì)胞，并在場(chǎng)景條件恐懼行為實(shí)驗(yàn)之后，全細(xì)胞記錄小鼠CA1印跡細(xì)胞（E）或非印跡細(xì)胞（N）。表達(dá)ChrimsonR的神經(jīng)元可被黃光激活，表達(dá)Chronos的神經(jīng)元可被藍(lán)光激活（圖4A-B）。

作者發(fā)現(xiàn)，場(chǎng)景條件恐懼行為實(shí)驗(yàn)后，小鼠CA3印跡細(xì)胞到CA1投射的PPR（Paired-pulse ratio，表征突觸前囊泡釋放的情況）降低，E-E投射PPR降低地最顯著，表明突觸前釋放能力的增強(qiáng)（圖4C-E）。隨后，他們使用Sr2 構(gòu)建單囊泡釋放誘發(fā)模型，監(jiān)測(cè)興奮性突觸后電流（EPSC），發(fā)現(xiàn)CA1印跡細(xì)胞接受的EPSC幅度最高，表明突觸后表達(dá)更多的AMPA受體（圖4F-G）。綜合上述兩個(gè)結(jié)果，記憶的形成會(huì)改變E-E之間的可塑性，即長時(shí)程增強(qiáng)（LTP）。

最后，作者在T-N、E-N、T-E、E-E之間誘導(dǎo)LTP，發(fā)現(xiàn)只有E-E之間的投射強(qiáng)度無變化，提示之前記憶的形成已經(jīng)誘發(fā)E-E之間的LTP，因此投射強(qiáng)度無法進(jìn)一步提高（圖4H-I）。

 圖4 記憶形成后CA3與CA1印跡細(xì)胞之間的突觸傳遞效率更高

總結(jié)：

記憶是腦的重要高級(jí)認(rèn)知功能，但是關(guān)于記憶存儲(chǔ)于哪些細(xì)胞、哪些突觸九游會(huì)j9了解不多，而該問題的解決是神經(jīng)科學(xué)的核心問題之一。本文首次利用dual-eGRASP新技術(shù)，標(biāo)記并檢測(cè)印跡細(xì)胞和非印跡細(xì)胞突觸的變化，提示記憶形成后印跡細(xì)胞與印跡細(xì)胞之間的突觸連接顯著增強(qiáng)。本文極大提高了九游會(huì)j9在學(xué)習(xí)記憶領(lǐng)域的認(rèn)知，這項(xiàng)技術(shù)將會(huì)深入挖掘腦科學(xué)，帶九游會(huì)j9找回大腦最深處的記憶！

九游會(huì)j9生物 一直關(guān)注神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大研究進(jìn)展，為神經(jīng)生理、病理研究提供最新工具和研究方案，助力臨床轉(zhuǎn)化和基因治療！

參考文獻(xiàn)：

1.Cabantous, S., T.C. Terwilliger, and G.S. Waldo, Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2005. 23(1): p. 102-7.

2.Choi, J.-H., et al., Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation. Science, 2018. 360(6387): p. 430-435.

3.Liu, X., et al., Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 2012. 484(7394): p. 381-5.