時(shí)間：2018-10-31 熱度：

活人能被尿憋死？

沒(méi)錯(cuò)，研究發(fā)現(xiàn)，排尿困難并非小事，它發(fā)生在男女老少各種人群身上，每年困擾著數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的患者。排尿（Urination）是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生理動(dòng)作，它是動(dòng)物從膀胱將尿自尿道排出體外的過(guò)程，其目的是清除代謝廢物，維持機(jī)體的體液平衡。健康人類(lèi)的排尿過(guò)程可以自主控制，而一些神經(jīng)受損者不能控制排尿。這種運(yùn)動(dòng)需要有良好的膀胱肌肉收縮、通暢的尿道以及神經(jīng)系統(tǒng)協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)排尿的大腦中樞包括腦橋排尿中樞（PMC）、導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)和大腦皮層。這其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)病變都可能造成膀胱的排尿動(dòng)作受到影響，導(dǎo)致排尿功能障礙，更甚者會(huì)誘發(fā)心血管疾病危及生命。

過(guò)去的研究已經(jīng)在腦皮層（如PMC）中發(fā)現(xiàn)與排尿有關(guān)的神經(jīng)元，但這些研究并未對(duì)自發(fā)性排尿控制的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制做明確的闡述。

2018年10月25日，《Nature Neuroscience》雜志在線刊登了第三軍醫(yī)大學(xué)姚基偉博士等人的重磅工作，該課題由第三軍醫(yī)大學(xué)鄢俊安課題組、諶小維課題組與中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院許曉鴻課題組合作完成[1]。

他們利用病毒示蹤、光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳、在體光纖記錄等技術(shù)，首先確定了初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層的一小簇第5層（L5）神經(jīng)元的活動(dòng)與排尿行為密切相關(guān)，并進(jìn)一步確定這群神經(jīng)元通過(guò)投射PMC觸發(fā)排尿行為。本篇文章首次解讀了L5皮層神經(jīng)元投射到PMC誘發(fā)排尿動(dòng)作的神經(jīng)回路機(jī)制，不僅極大提高了人們對(duì)該領(lǐng)域的認(rèn)知，也為治療排尿功能障礙相關(guān)疾病提供了新的思路。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.M1區(qū)L5神經(jīng)元的活動(dòng)與排尿密切相關(guān)

利用偽狂犬病毒的逆向示蹤，作者首先標(biāo)記了成年雄性小鼠膀胱壁與初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和初級(jí)感覺(jué)皮層的逆向跨突觸的聯(lián)系（圖1），且這些投射多位于皮層M1和S1區(qū)的第五層（圖1b-f）。

圖1 L5皮層錐體神經(jīng)元標(biāo)記

借助基于光纖記錄的鈣成像技術(shù)和AAV病毒載體,作者記錄標(biāo)記上述L5皮層神經(jīng)元是否參與了排尿行為（圖2a-b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ca² 瞬時(shí)變化在尿液釋放開(kāi)始前立刻被捕捉到（圖2c-d），在所有的記錄中，約94%的排尿與M1區(qū)Ca² 瞬時(shí)變化有關(guān)（圖2e-f）。進(jìn)一步，作者發(fā)現(xiàn)M1區(qū)L5神經(jīng)元的膀胱壓力峰值與Ca² 瞬時(shí)變化密切相關(guān)（圖2h-i），且M1區(qū)神經(jīng)元向膀胱傳遞的通路活動(dòng)與排尿正相關(guān)（圖2j-k）。這些結(jié)果提示M1區(qū) L5皮層神經(jīng)元可能在排尿的起始過(guò)程中扮演著重要的角色。

圖2 M1區(qū)L5神經(jīng)元的活動(dòng)與排尿密切相關(guān)

2.激活大腦M1區(qū)L5皮層興奮神經(jīng)元會(huì)觸發(fā)膀胱收縮和排尿

接下來(lái)，研究人員雙側(cè)注射AAV病毒載體（AAV-CaMKⅡ-ChR2-mCherry）表達(dá)光敏感通道，并用光遺傳學(xué)技術(shù)刺激這些神經(jīng)元，記錄麻醉動(dòng)物膀胱尿道肌肉的電活動(dòng)（圖3a）。發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光激活表達(dá)ChR2的M1區(qū)神經(jīng)元時(shí)，膀胱逼尿肌的電活動(dòng)增強(qiáng)、肌肉收縮（圖3c-e），同時(shí)膀胱壓力值顯著增加（圖3f），提示了激活大腦M1區(qū)L5皮層神經(jīng)元會(huì)引起膀胱收縮，增長(zhǎng)收縮時(shí)間。

圖3 光刺激L5興奮性神經(jīng)元導(dǎo)致膀胱收縮

進(jìn)一步，作者用光遺傳學(xué)技術(shù)（圖4a）直接激活M1區(qū)L5神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)該操作可以引起自由活動(dòng)小鼠的排尿行為，且排尿行為發(fā)生在光刺激的4min內(nèi)（圖4b-d）。

圖4 光刺激L5神經(jīng)元會(huì)引發(fā)排尿動(dòng)作

3.大腦M1區(qū)L5皮層神經(jīng)元通過(guò)投射到PMC導(dǎo)致排尿

接下來(lái)，作者使用基于AAV病毒載體的病毒環(huán)路示蹤技術(shù)，探索M1區(qū)L5神經(jīng)元介導(dǎo)膀胱收縮和排尿行為的神經(jīng)環(huán)路。

通過(guò)局部注射AAV-CaMKⅡ-EGFP病毒，作者發(fā)現(xiàn)L5神經(jīng)元其可直接投射到PMC區(qū)。隨后，研究人員在M1區(qū)和PMC分別注射具順向跨突觸能力的AAV病毒--AAV2/1-hSyn-Cre和AAV-DIO-GCaMP6s，發(fā)現(xiàn)這群投射到PMC的錐體神經(jīng)元參與排尿行為（圖5a），且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ca² 的瞬時(shí)變化開(kāi)始于排尿前，并持續(xù)整個(gè)排尿過(guò)程（圖5b-d）。

圖5 排尿相關(guān)Ca² 信號(hào)

進(jìn)一步，研究人員在M1區(qū)注射AAV2/1-hSyn-Cre和AAV-DIO-ChR2病毒，同時(shí)在PMC注射AAV-DIO-GCaMP6s病毒（圖6a），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用光刺激大腦M1區(qū)L5錐體神經(jīng)元可顯著性增加Ca² 濃度（圖6b）。研究還發(fā)現(xiàn)，PMC神經(jīng)元活性是L5皮層神經(jīng)元觸發(fā)排尿活動(dòng)（圖4）所必需的（圖6c-d）。此外，作者利用病毒示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)對(duì)PMC神經(jīng)元進(jìn)行光刺激會(huì)導(dǎo)致行為自由小鼠的排尿動(dòng)作（圖6e-g）。

綜上，這些病毒示蹤的結(jié)果提示了這些大腦M1區(qū)L5錐體神經(jīng)元通過(guò)激活PMC導(dǎo)致排尿行為（圖6h）。

圖6 大腦M1區(qū)神經(jīng)元通過(guò)激活PMC控制排尿行為

4.大腦M1區(qū)L5皮層錐體神經(jīng)元是正常排尿行為所必需的

最后，作者利用化學(xué)遺傳技術(shù)（基于AAV-CaMKⅡ-hM4Di-mCherry），使用CNO抑制M1區(qū)L5皮層神經(jīng)元（圖7a），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該操作可以顯著抑制排尿行為，減少排尿反應(yīng)，延長(zhǎng)第一次排尿的潛伏期，以及尿液沉淀總量（與對(duì)照組相比，圖7d）。

另外，研究人員利用Cre誘導(dǎo)表達(dá)的taCasp3（靶向神經(jīng)元）觸發(fā)L5投射神經(jīng)元細(xì)胞凋亡（圖7e），發(fā)現(xiàn)該操作導(dǎo)致小鼠排尿功能異常，且膀胱明顯大于對(duì)照組（圖7f-j）。再次證明大腦M1區(qū)L5皮層錐體神經(jīng)元在排尿過(guò)程的重要作用。

圖7 沉默或殺掉M1區(qū)L5神經(jīng)元會(huì)削弱排尿

結(jié)論

排尿功能障礙性疾病是指各種原因引起的排尿異常，以尿失禁、尿潴留、尿頻尿急、排尿困難等為主要癥狀的癥候群，是泌尿外科常見(jiàn)的疾病之一。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)L5皮層神經(jīng)元投射到PMC誘發(fā)排尿動(dòng)作的神經(jīng)回路機(jī)制，極大提高了人們對(duì)該領(lǐng)域的認(rèn)知，揭示了皮層排尿環(huán)路，為治療排尿功能障礙相關(guān)疾病提供了新的思路。

此外，九游會(huì)j9生物 有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的大量AAV工具病毒，從神經(jīng)環(huán)路到光遺傳、化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，到神經(jīng)元消亡，用實(shí)際行動(dòng)助力中國(guó)腦科學(xué)的發(fā)展。

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參考文獻(xiàn)

1.Yao, J., Q. Zhang, X. Liao, Q. Li, S. Liang, X. Li, et al., A corticopontine circuit for initiation of urination. Nat Neurosci, 2018. 21(11): p. 1541-1550. DOI: 10.1038/s41593-018-0256-4.