時(shí)間：2018-09-06 熱度：

最近各種宮廷攻略刷屏，今天出出戲，來(lái)了解一款 “網(wǎng)紅”m6A。人們很早就發(fā)現(xiàn)mRNA存在著腺嘌呤上的甲基化修飾（m6A）。越來(lái)越多的證據(jù)表明高等生物mRNA和lncRNA上普遍存在m6A修飾，近來(lái)發(fā)現(xiàn)mirRNA、cirRNA及rRNA都存在這種修飾。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyl-adenosine(m6A))是高等生物中含量最為豐富的一種RNA甲基化形式，平均每一條mRNA含有3-5個(gè)，存在于保守序列RRACH（R=G ,A; H=A,C or U）的腺嘌呤上。其功能由“編碼器”（Writer）、“讀碼器”（Reader）及“消碼器”（Eraser）協(xié)同起作用。編碼器（Writer）即甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14等，消碼器（Eraser）可逆轉(zhuǎn)甲基化有FTO、ALKBH等，m6A由m6A結(jié)合蛋白（讀碼器（Reader））識(shí)別，目前發(fā)現(xiàn)的有YTH等結(jié)構(gòu)域蛋白。

這種修飾是可逆的，通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14，去甲基轉(zhuǎn)移酶FTO和ALKBH5調(diào)控其生物學(xué)特性。m6A修飾在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，如轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控RNA穩(wěn)定性、運(yùn)輸、剪切等¹。研究表明m6A mRNA甲基化影響干細(xì)胞和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖^2-4。然而，m6A甲基化如何影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及哪些潛在途徑和機(jī)制調(diào)節(jié)這些變化仍未得到充分闡明。

近日來(lái)自霍華德-休斯醫(yī)學(xué)研究所和芝加哥大學(xué)的Chuan He和Ernst Lengyel在《自然細(xì)胞生物學(xué)》上發(fā)表了最新的研究成果。低水平的m6A mRNA甲基化通過(guò)影響AKT信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和致瘤性。

結(jié)果

1.低水平m6A mRNA甲基化與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中m6A轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體核心亞基METTL14的298位點(diǎn)頻繁突變，導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶功能失活，抑制mRNA總的m6A甲基化水平。相對(duì)于正常組織，70%的腫瘤（包括METTL14野生型）都出現(xiàn)總m6A mRNA甲基化水平下降。(Fig. 1a-e)。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與相鄰的正常組織相比，癌組織中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)顯著下降(Fig. 1f)。METTL3的表達(dá)與腫瘤組織中m6A mRNA甲基化水平正相關(guān)。免疫組化在蛋白水平上得到一致的結(jié)果(Fig. 1g)。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中METTL14突變與METTL3的表達(dá)減少是不共存的，METTL14突變METTL3的表達(dá)就是正常的。癌癥基因組圖譜TCGA數(shù)據(jù)分析顯示兩者沒(méi)有明顯的相關(guān)性。結(jié)果表明大部分的子宮內(nèi)膜癌都表現(xiàn)出由于METTL14突變或METTL3的表達(dá)減少而導(dǎo)致的低水平的m6A mRNA甲基化。

圖1  METTL14突變及METTL3表達(dá)下降減少子宮內(nèi)膜癌患者的m6A mRNA甲基化水平

2.異常m6A甲基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖

m6A甲基化的水平與細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)，尤其是對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子甲基化的影響。為了研究METTL14功能缺失對(duì)腫瘤細(xì)胞系的影響。研究人員用CRISPR技術(shù)敲除HEC-1-A（子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系）中METTL14。蛋白質(zhì)印：筒廡蚍治隹芍貿(mào)赴刀際竊雍锨貿(mào)。METTL14 ^/–敲除細(xì)胞系中m6A甲基化水平下降和腫瘤樣本中觀察到的結(jié)果一致(Fig. 2a)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、克隆形成、細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)（Fig. 2b-e）。病毒介導(dǎo)的RNA干擾敲低HEC-1-A細(xì)胞系中METTL3的表達(dá)與METTL14 ^/–得到的結(jié)果一致（Fig. 2f-j）。

為了驗(yàn)證體外細(xì)胞系觀察到的表型，作者進(jìn)一步研究了體內(nèi)METTL14 ^/–和METTL3對(duì)腫瘤發(fā)生的影響。將野生型HEC-1-A細(xì)胞系和METTL14 ^/–敲除HEC-1-A細(xì)胞系分別注射到裸鼠的腹腔膜，2-3周后觀察腫瘤的大小和數(shù)量。注射METTL14 ^/–敲除細(xì)胞的小鼠成瘤更大轉(zhuǎn)移數(shù)量更多（Fig. 2k）。在注射野生型和突變METTL14上（Fig. 2l）以及敲低METTL3和對(duì)照細(xì)胞的裸鼠上觀察到相似的趨勢(shì)（Fig. 2m）。

圖2 低水平m6A甲基化促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移以及活體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)

3.m6A-seq檢測(cè)出子宮內(nèi)膜腫瘤中甲基化改變的轉(zhuǎn)錄

研究人員對(duì)來(lái)源于病人腫瘤組織和相鄰正常組織做了m6A-seq檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)m6A峰值在腫瘤組織中只有正常組織的一半（Fig. 3a）。m6A甲基化減少的轉(zhuǎn)錄本主要富集在與細(xì)胞遷移、增殖、生長(zhǎng)、粘附和細(xì)胞死亡相關(guān)的基因本體（GO）位置。在敲低METTL3 和METTL14突變的的HEC-1-A細(xì)胞系也得到一致的結(jié)果。

圖3  腫瘤組織m6A甲基化水平下降

4.m6A甲基化調(diào)控AKT信號(hào)通路的激活

AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，在子宮內(nèi)膜癌和其他癌癥通過(guò)致癌突變激活。研究發(fā)現(xiàn)與正常鄰近組織相比，腫瘤中參與AKT途徑的許多基因顯示出m6A甲基化減少（Fig. 3c,d）。研究發(fā)現(xiàn)METTL14功能缺失的hec-1-a細(xì)胞系與對(duì)照相比，AKT絲氨酸(S473)磷酸化水平顯著提高(Fig. 4a)。蘇氨酸和總AKT蛋白表達(dá)水平?jīng)]有改變。AKT磷酸化的這些變化刺激AKT信號(hào)，導(dǎo)致AKT下游效應(yīng)因子的磷酸化的增加(Fig. 4b)。說(shuō)明低水平的m6A甲基化通過(guò)磷酸化激活A(yù)KT信號(hào)通路。

圖4  減少的m6A甲基化激活A(yù)KT

5.m6A甲基化控制AKT激活調(diào)控因子的表達(dá)

進(jìn)一步研究PHLPP2（編碼蛋白磷酸酶，AKT去磷酸化失活）和mTORC2（一種磷酸化AKT的激酶）來(lái)確定低水平m6A甲基化作用下AKT激活的機(jī)制。編碼PHLPP2和mTORC2復(fù)合體（PRR5、PRR5L和mTOR）的轉(zhuǎn)錄本在患者樣本中也顯示m6A甲基化的減少（Fig. 4c）。在這些細(xì)胞系中，觀察到PHLPP2蛋白的表達(dá)減少，而其mRNA水平?jīng)]有明顯改變；相反，p-mTOR（mTORC2的標(biāo)記）除了蛋白質(zhì)水平增加，PRR5、PRR5L和mTOR的mRNA表達(dá)也增加（Fig. 4a,d）。免疫組化結(jié)果PHLPP2在腫瘤組織中確實(shí)下降（Fig. 4e,f）。

接下來(lái)研究m6A甲基化如何調(diào)控PHLPP2和mTORC2的表達(dá)。病毒介導(dǎo)在HEC-1-A細(xì)胞系中敲低YTHDF1（閱讀蛋白的一種促進(jìn)m6A的轉(zhuǎn)錄和翻譯）的確減少了PHLPP2的表達(dá)(Fig. 5a)。PHLPP2表達(dá)的這些變化不是由于PHLPP2轉(zhuǎn)錄本數(shù)量變化，而是由于激活PHLPP2轉(zhuǎn)錄核糖體的變化（Fig. 5a,c）。而PRR5、PRR5L和mTOR的轉(zhuǎn)錄本是受YTHDF2（介導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄本降解）的影響（Fig. 5d,e）。干擾結(jié)果證實(shí)減少的m6A甲基化減弱YTHDF1對(duì)PHLPP2（AKT負(fù)調(diào)控調(diào)）促翻譯，減少YTHDF2對(duì)mTORC2（AKT正調(diào)控）轉(zhuǎn)錄本的降解。

圖5 m6A結(jié)合蛋白調(diào)控AKT通路相關(guān)基因表達(dá)

6.低m6A甲基化增加AKT信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞增殖

進(jìn)一步研究證明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中減少的甲基化通過(guò)激活A(yù)KT來(lái)促進(jìn)增殖。過(guò)表達(dá)PHLPP2和抑制mTORC2（敲低mTORC2的關(guān)鍵基因RICTOR）都減少了AKT磷酸化的水平，從而減緩了由于敲低METTL3，突變METTL14和METTL14 /-等引起子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1-A的增殖（Fig. 6）。

圖6 低水平m6A調(diào)控AKT信號(hào)影響細(xì)胞增殖

總結(jié)

N6-甲基腺苷(m6A)mRNA甲基化是一種影響癌癥進(jìn)程中細(xì)胞分化和增殖的基因調(diào)控機(jī)制。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)分析、甲基化水平檢測(cè)、基于病毒載體在細(xì)胞和動(dòng)物模型上進(jìn)行基因表達(dá)水平操作（敲除、RNA干擾和過(guò)表達(dá)），證實(shí)低水平m6A甲基化通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)途徑導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和致瘤性。m6A可能是腫瘤治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

1.Liu, N. et al. N6-methyladenosine-dependent RNA structural switches regulate RNA–protein interactions. Nature 518, 560–564 (2015).

2.Geula, S. et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of na?ve pluripotency toward differentiation. Science 347, 1002–1006 (2015).

3.Batista, P. J. et al. m6A RNA modification controls cell fate transition in mammalian embryonic stem cells. Cell Stem Cell 15, 707–719 (2014).

4.Zhao, B. S. et al. m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition. Nature 542, 475–478 (2017).