福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded，F(xiàn)FPE）樣本是臨床上長期保存病理樣本的常用方法，可以和臨床數(shù)據(jù)（如患者臨床資料，患者生存預后信息，用藥和治療療效等）相關聯(lián)，為確定疾病的發(fā)生發(fā)展機制研究、生物標志物和藥物靶標提供了巨大的資源，是進行回顧性研究的不二之選。但FFPE處理會使組織中的核酸發(fā)生不同程度的降解，在過去由于技術受限使FFPE樣本無法發(fā)揮自身的價值。隨著技術的不斷突破，針對石蠟樣本提供了全套的解決方案。

10x Genomics Flex可鎖定 RNA 的瞬時表達狀態(tài)，解決了單細胞樣本儲存運輸、多樣本批量處理以及混樣測序的問題。針對FFPE樣本，使用二jia ben脫蠟，使用膠原酶、胰蛋白酶等多種酶來消化組織，制備單細胞懸浮液，進而抽核得到細胞核樣本；建庫時采用靶向基因的探針對雜交目標 RNA 分子后連接的原理，進而完成文庫構建的過程。10x Genomics Flex可以用來分析數(shù)千個至數(shù)萬個細胞核的基因表達，能夠對人或小鼠的 FFPE 樣本進行單細胞轉錄組分析。

圖1. 10x Genomics Flex工作流程

應用案例：FFPE組織的單細胞+空轉+原位分析聯(lián)合繪制高分辨率乳腺癌微環(huán)境圖譜

該研究對一個乳腺癌FFPE 樣本進行連續(xù)切片，采用單細胞基因表達（Flex，scFFPE-seq），空間轉錄組（Visium CytAssist）和原位技術（Xenium）對乳腺癌FFPE 樣本進行檢測。通過這三種數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，實現(xiàn)了FFPE樣本單細胞水平下基因表達，空間信息及原位基因表達信息的整合。其中Flex和CytAssist數(shù)據(jù)聯(lián)合分析鑒定出17種不同的細胞類型，再通過將轉錄本映射到 Xenium中，以單細胞分辨率在空間層面上解析這些細胞類型及其基因表達特征，從而展示了樣本高空間分辨的全轉錄組信息。

圖2. FFPE Flex和CytAssist的細胞類型注釋

10x Visium CytAssist技術方案一經(jīng)推出就備受矚目，不僅完美解決了傳統(tǒng)方案在FFPE樣本的痛點，并且對樣本要求更低，以卓越的數(shù)據(jù)表現(xiàn)備受好評?；贑ytAssist儀器進行檢測，可根據(jù)組織大小進行靈活選用（6.5mm×6.5mm 或11mm×11mm）。

圖3. 10x Visium CytAssist玻片

與標準Visium完全不同，相比于標準Visium的55 μm 點陣、六邊形排列的信號點，HD則采用了2 μm的方形連續(xù)網(wǎng)格圖案，彼此之間沒有間隙，大大提升了信號密度，可以實現(xiàn)單細胞的分辨率。Visium HD平臺提供了全轉錄組測序，兼容物種為人和小鼠，兼容組織類型是FFPE組織樣本。Visium HD支持定位組織駐留細胞群，包括免疫細胞或癌細胞，發(fā)現(xiàn)它們的相互作用和對疾病或治療反應的貢獻。

圖4. 10x Visium HD玻片

應用案例：10x HD空轉解析腸癌微環(huán)境

Visium HD的單細胞分辨率能夠繪制不同的免疫細胞群，并評估腫瘤邊界的不同基因表達，以探索免疫細胞群在TME中的潛在貢獻。結直腸癌是一種影響結腸或直腸的癌癥，是全世界最常見的癌癥類型之一，可以導致嚴重傷害和死亡，結直腸癌的風險隨著年齡的增長而增加。該研究將全轉錄組和靶向原位空間技術相結合，深入地揭示了TME的復雜性和動態(tài)性，突出了空間環(huán)境對理解癌癥異質性和進展的重要性。

圖5. 研究路線

轉錄組研究對于理解基因組功能元件、揭示細胞及組織中分子組成以及探索機體發(fā)育和疾病機制具有重要作用。通過高通量測序對FFPE中l(wèi)ncRNA 和mRNA進行測序分析。

石蠟樣本實測數(shù)據(jù)顯示：

1）取4個不同降解程度的FFPE-RNA樣本(DV200在60%-80%之間)，用其進行文庫制備文庫及NGS分析。

2）4個FFPE樣本的基因組比對率均在85%以上，且均有較高的轉錄本檢測數(shù)。

圖6.各樣本FPKM小提琴圖

基于FFPE樣本開展差異蛋白質組學研究，可以充分利用罕見疾病或腫瘤等樣本，研究疾病發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)與疾病診斷、分型、預后與治療密切相關的生物標志物。采用DIA或 Astral技術進行全景式的數(shù)據(jù)采集，無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，更大程度鑒定樣本中的低豐度蛋白。

FFPE實測數(shù)據(jù)顯示：

結合SDS PAGE條帶和蛋白總量進行質檢判定，用其進行質譜分析。

FFPE樣本的蛋白鑒定數(shù)可達到4000+。

圖7.FFPE SDS PAGE結果

全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)指利用捕獲技術將全基因組的外顯子區(qū)域DNA捕獲富集后進行高通量測序，能夠直接發(fā)現(xiàn)與蛋白質功能變異相關的單核苷酸位點變異（Single nucleotide variants，SNV）、插入缺失位點（InDel，Insertion/Deletion）和結構變異位點（SV，Structure Variation）等信息。以人類基因組為例，雖然外顯子(蛋白質編碼區(qū))只占基因組的1%，但人類基因組85%致病突變都在外顯子區(qū)域，因此具有重要意義。

FFPE WES實測數(shù)據(jù)顯示：

平均捕獲率（ontarget ratio）可達到60%-80%以上。

參考文獻