腫瘤微環(huán)境 (TME) 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和藥物敏感性中發(fā)揮重要作用。基于腫瘤-免疫系統(tǒng)相互作用模式，將 TME 分為四種主要類型“Hot”、“Cold”、“IMS”、 “IME”。據(jù)報(bào)道，在一些腫瘤中，如結(jié)腸癌和黑色素瘤，TME溫度越高，患者生存率越高。然而，TME的高度異質(zhì)性仍然是理解和治療癌癥的一個(gè)關(guān)鍵障礙。原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤 (PCNSL) 是一種高度侵襲性非霍奇金淋巴瘤，見于中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS)，包括腦、脊柱、腦脊液 (CSF) 和眼，PCNSL患者的生存率通常較低。盡管已在單細(xì)胞水平上研究PCNSL 的細(xì)胞組成和基因表達(dá)模式，但缺失了空間定位信息。因此，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組測序來闡明 TME 的空間和時(shí)間發(fā)展模式以及關(guān)鍵的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。
結(jié)果1 PCNSL TME圖譜分析
從PCNSL患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中獲得14964個(gè)細(xì)胞，共注釋出5個(gè)細(xì)胞類型（T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞）。因考慮到 T細(xì)胞在TME 環(huán)境中的重要性，將其進(jìn)一步分為7個(gè)T細(xì)胞亞群：CD4+ naïve、Treg、CD4+ exhausted、effect memory T-cell (TEM)、CD8+ naïve、CD8+ toxic T-cell (TOX)、CD8+ exhausted cell。同時(shí)對(duì)每份樣本進(jìn)行評(píng)分，將樣本分為4類，分別為：“Hot” TME、“Cold” TME、“IMS” TME、“IME” TME；并選擇4個(gè)代表性腫瘤組織進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序分析。
圖1 PCNSL TME圖譜分析
結(jié)果2 PCNSL TME的空間異質(zhì)性分析
結(jié)合免疫評(píng)分和免疫微環(huán)境特征，選擇4個(gè)典型樣本進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測序。采用每個(gè)celltype 的top 30 進(jìn)行對(duì)每一個(gè)spot進(jìn)行評(píng)分，對(duì)空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類型映射注釋?？紤]到TME 中腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，將腫瘤細(xì)胞注釋成不同的細(xì)胞亞群（圖2A）。在Cold TME中，只有少數(shù) T 細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞在空間水平上形成明顯的簇（圖2B）。對(duì)于另外兩種中間狀態(tài)，IMS TME中只有少量 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集在腫瘤區(qū)域的邊界，腫瘤細(xì)胞似乎具有更明顯的空間異質(zhì)性，腫瘤的外部和內(nèi)部形成不同的簇（圖2C）。IME TME被定義為侵襲性邊緣有大量免疫細(xì)胞的狀態(tài), 腫瘤異質(zhì)性和物種空間分布更為明顯，腫瘤細(xì)胞由內(nèi)向外移動(dòng)形成“onion cascading structure”，每層似乎狀態(tài)不同（圖2D）。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞形成了特殊的空間分布，可能有其各自分工。
圖2 PCNSL TME 的空間形態(tài)和異質(zhì)性
結(jié)果3 PCNSL 細(xì)胞亞群注釋
為了進(jìn)一步探索每個(gè)腫瘤簇的特異性功能，對(duì)每個(gè)cell cluster的all DEG進(jìn)行GO富集分析，默認(rèn)采用 top10 GO terms來闡述其功能?；诿庖咄返腉SVA評(píng)分來判定腫瘤是處于被動(dòng)防御還是侵襲狀態(tài)（圖3A和3B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hot中大部分腫瘤細(xì)胞處于被動(dòng)防御狀態(tài)，而Cold中的腫瘤細(xì)胞基本失去了免疫細(xì)胞的監(jiān)督，處于負(fù)性免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)。對(duì)于 IMS，兩種狀態(tài)共存；IME處于免疫抑制狀態(tài)。
通過注釋每種Cancer cell 功能以進(jìn)一步闡明了腫瘤的空間異質(zhì)性。將Hot中的被動(dòng)防御腫瘤細(xì)胞定義為“defenders”，主要分布在Cancer cell 1和Cancer cell 2；從空間位置來看，主要分布在上半部分。Cancer cell 3具有非常強(qiáng)的固醇代謝功能以對(duì)抗免疫細(xì)胞，因此將其定義為“attacker”。Cancer cell 4和Cancer cell 6分散在整個(gè)空間中，負(fù)責(zé)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和能量供應(yīng)，因此將其命名為“engineers”和“energy suppliers” （圖3C）。Cold腫瘤中，沒有處于免疫防御狀態(tài)的癌細(xì)胞，表現(xiàn)出很強(qiáng)的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)能力；值得注意的是，有一簇高度增殖的癌細(xì)胞（Cancer cell 2），將其命名為“aggressors” （圖3C）。IMS 腫瘤中的癌細(xì)胞狀態(tài)與前兩種狀態(tài)具有相似性，但也有其自身的差異。與 T 細(xì)胞直接接觸的 IMS 腫瘤中的Cancer cell 2顯示出正性和負(fù)性免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)，并且似乎處于聚集 T 細(xì)胞的過渡階段，而相對(duì)靠近內(nèi)部的Cancer cell 1和3顯示出較強(qiáng)的增殖特征。由于Cancer cell 4在 IMS 腫瘤中的主要功能是 ncRNA 的代謝重編程，它被命名為“organizers”(圖3C)。在 IME 腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了相同的簇（organizers），似乎棲息在空間位置的核心，空間位置疊加在腫瘤的內(nèi)部區(qū)域上。以Cancer cell 4為中心向外延伸，周圍的Cancer cell 5與其相似，具有較強(qiáng)的 ATP 代謝能力(圖3C)。
圖3 PCNSL細(xì)胞亞群的功能注釋及空間分布分析
結(jié)果4 TME 中重塑模式和免疫壓力傳感模型
對(duì) PCNSL 腫瘤亞群進(jìn)行功能注釋后，發(fā)現(xiàn)一些癌癥簇似乎具有很強(qiáng)的相關(guān)性和相似性，因此，探索了TME 中腫瘤細(xì)胞簇的發(fā)育軌跡。結(jié)果表明，Hot腫瘤作為發(fā)展的起點(diǎn)，在晚期有兩種不同的細(xì)胞命運(yùn)，一種是cold tumor，另一種為IME tumor，將這種腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化形式稱為“TME remodeling pattern”(圖4A)。Gene Switch 分析獲得了熱腫瘤向冷腫瘤發(fā)展，以及 IME 腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵開關(guān)基因（圖4B）。
通過這種方式，將4個(gè)微環(huán)境中不同的腫瘤細(xì)胞亞群聯(lián)系在一起，了解它們的相互關(guān)系和發(fā)育軸（圖4C）。在經(jīng)歷了免疫細(xì)胞的挑戰(zhàn)后，defenders衍生出attackers，attackers在免疫細(xì)胞壓力較低的情況下生成aggressors擴(kuò)大腫瘤；而organizers則衍生出組織腫瘤細(xì)胞構(gòu)建免疫細(xì)胞高壓區(qū)域的屏障環(huán)境，如血管分布較大的 IME 環(huán)境。將這種對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性命運(yùn)的免疫壓力形式稱為“Immune pressure-sensing model” （圖4C）。
圖4 TME 重塑模式和免疫壓力感知模型
結(jié)果5 FKBP5+ 亞群促進(jìn)了TME remodeling pattern的形成
為探索organizers在血腦屏障中的關(guān)鍵作用，進(jìn)行WGCNA分析，篩選出了2個(gè)與organizers具有顯著性關(guān)聯(lián)的？椋╞lue modules、green modules）；隨后通過模塊基因的互作網(wǎng)路分析，最終篩選出 10 個(gè)與患者生存密切相關(guān)的基因（圖 5A-C）?？紤]到organizers的形成過程與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，因此基于GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)FKBP5 與患者的腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)（圖 5C）。
圖5 FKBP5+ 亞群促進(jìn)TME remodeling pattern 形成
結(jié)果6 TME remodeling pattern的分子機(jī)制
TME中T細(xì)胞的狀態(tài)尤為重要，因此通過細(xì)胞通訊分析了腫瘤細(xì)胞亞群與不同T細(xì)胞亞群之間的相互作用。在Hot腫瘤中，發(fā)現(xiàn)CD8 TOX T細(xì)胞與其他細(xì)胞的交流最為密切，其中CXCR4-CXCL12 信號(hào)軸尤其重要，CXCR4-CXCL12信號(hào)軸在熱 TME 中被廣泛激活（圖6A和6B）。在Cold腫瘤中最重要的是 CD99 信號(hào)軸，CD99信號(hào)軸廣泛分布在整個(gè)Cold TME 中（圖6B）。IMS腫瘤各細(xì)胞群之間的通訊相對(duì)比較密集，ITGAM + ITGB2-ICAM1信號(hào)軸具有最重要的意義，該信號(hào)軸的最終接受者是免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，代表了腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞在這種狀態(tài)下的劇烈變化。同時(shí)，ITGAM + ITGB2-ICAM1信號(hào)軸的空間分布也集中在腫瘤細(xì)胞與 T 細(xì)胞緊密接觸的區(qū)域，進(jìn)一步反映了該區(qū)域強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)(圖6B和6C)。對(duì)于 IME腫瘤，信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的中心是 CD4 exhausted T cells，整個(gè) TME 中的細(xì)胞間相互作用遠(yuǎn)弱于其他TME；其中ANXA1-FPR1信號(hào)軸最重要，構(gòu)建屏障環(huán)境和加強(qiáng)緊密連接的信號(hào)軸處于次要位置；ANXA1-FPR1信號(hào)軸作用于CD4- exhausted T cells 和 CD8- exhausted T cells，使其處于抗炎狀態(tài)（圖6B 和6C）。屏障環(huán)境和加強(qiáng)細(xì)胞間緊密連接的信號(hào)軸使免疫細(xì)胞難以進(jìn)入腫瘤。這些結(jié)果表明，耗竭T 細(xì)胞大多數(shù)是聚集在侵襲性邊緣的 T 細(xì)胞，進(jìn)一步表明促進(jìn) T 細(xì)胞耗竭的各種分子可能起著至關(guān)重要的作用，這對(duì)于腫瘤免疫治療非常重要。
圖6 TME中腫瘤細(xì)胞與各個(gè)T細(xì)胞亞群之間的細(xì)胞互作關(guān)系
結(jié)果7 腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的空間表達(dá)分析
在目前的腫瘤免疫治療中，免疫檢查點(diǎn)分子抑制劑和 CAR-T 治療已被證明是最有效的。通過探究免疫檢查點(diǎn)分子及其相應(yīng)配體的空間表達(dá)，發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)分子及其受體在不同的 TME 中可表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和空間異質(zhì)性。PD-L1的表達(dá)分布在Hot TME中，并在該發(fā)育階段結(jié)束時(shí)表現(xiàn)出表達(dá)增加的趨勢（圖7A）。在IMS TME中，PD-L1表達(dá)集中在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的侵襲性邊緣，與 PD-1 充分結(jié)合，促進(jìn) T 細(xì)胞耗竭。在Cold TME和 IME TME中，腫瘤細(xì)胞似乎已占主導(dǎo)地位，并逐漸降低。
在 CAR-T 療法中，主要靶點(diǎn) CD19 也具有獨(dú)特的空間表達(dá)差異。在Hot TME中， CD19 表達(dá)相對(duì)較弱，但在Cold TME和 IMS TME中，CD19表達(dá)顯著增加。在 IME TME中，高表達(dá) CD19 的腫瘤細(xì)胞甚至被包裹在腫瘤內(nèi)部，使得 CAR-T 細(xì)胞難以發(fā)揮靶向作用，這很可能是治療效果大大降低的原因之一（圖7B）。
這些結(jié)果表明，免疫治療中分子的表達(dá)可能并不是簡單的幅度變化或隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，它們的表達(dá)很可能伴隨著空間位置的獨(dú)特變化。如果九游會(huì)j9能夠利用這類分子獨(dú)特的表達(dá)模式，將更有利于提高免疫治療的準(zhǔn)確性和效率。
圖7 腫瘤免疫治療靶點(diǎn)的空間表達(dá)分析
總結(jié)
腫瘤亞群空間分布不均勻和免疫治療相關(guān)靶分子空間分布不均勻可能是治療效果不佳的原因。在抑制劑和免疫檢查點(diǎn)藥物的選擇上，不同狀態(tài)的 TMEs 對(duì)藥物的反應(yīng)可能完全不同，CAR-T治療的治療效果也可能由于 TME 的空間差異而不同。此外，相應(yīng)的藥物和治療方法可以根據(jù)不同 TME的發(fā)育階段進(jìn)行調(diào)整，在腫瘤的精準(zhǔn)治療中具有重要意義。
參考文獻(xiàn)
Xia Y, Sun T, Li G, Li M, Wang D, Su X, Ye J, Ji C. Spatial single cell analysis of tumor microenvironment remodeling pattern in primary central nervous system lymphoma. Leukemia. 2023 Jul;37(7):1499-1510. PMID: 37120690; PMCID: PMC10317840.
