慢性胰腺炎(CP)是一種由遺傳和環(huán)境因素引起的終身進(jìn)行性纖維炎性疾。涮卣魘歉雇，急性胰腺炎(AP)反復(fù)發(fā)作，胰腺功能隨著時(shí)間的推移而惡化。CP表現(xiàn)為胰腺損傷、纖維化及胰腺內(nèi)外分泌功能不全，部分患者最終會(huì)發(fā)展為胰腺癌，嚴(yán)重：θ嗣襠鈧柿考吧硤褰】?。闰范乌，CP的發(fā)病率及患病率逐年上升，我國現(xiàn)有確診CP患者逾100萬例，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大。然而目前還沒有根治CP的方法，迫切需要有效的治療和疾病預(yù)防策略。
絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal1型(SPINK1)編碼胰腺分泌性胰蛋白酶抑制劑(PSTI)，是與胰腺炎相關(guān)的主要基因之一。SPINK1/PSTI在胰腺腺泡細(xì)胞中合成，被認(rèn)為是通過抑制過早激活的胰蛋白酶來抵抗胰腺炎的第一道防線。SPINK1基因的功能缺失突變破壞了胰蛋白酶激活和抑制之間的平衡，導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展。SPINK1基因過表達(dá)能夠持續(xù)抑制活性胰蛋白酶，為治療CP提供了一種新的方法。
2024年3月29日，海軍軍醫(yī)大學(xué)廖專及鄒文斌共同通訊在消化領(lǐng)域TOP期刊Gut（IF=25）發(fā)表題為“Pancreas-directed AAV8-hSPINK1 gene therapy safely and effectively protects against pancreatitis in mice”的研究論文，該研究表明胰腺導(dǎo)向的AAV8-hSPINK1基因治療安全有效地改善小鼠胰腺炎。
結(jié)果
1. rAAV8-hSPINK1在小鼠體內(nèi)具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和強(qiáng)表達(dá)能力
本研究選用衣殼優(yōu)化（酪氨酸（Y）殘基定點(diǎn)誘導(dǎo)突變?yōu)楸奖彼幔‵））的AAV8載體，作為正常人SPINK1基因的遞送載體（AAV8-hSPINK1），該載體可減少細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體降解，提升對(duì)胰腺組織的感染效率。該研究發(fā)現(xiàn)，AAV8-hSPINK1在小鼠胰腺中最佳感染總量為2E+11vg/只。該載體在注射體內(nèi)后第四周hSPINK1表達(dá)量達(dá)峰，且保持顯著水平至少持續(xù)8周。
圖1 AAV8-hSPINK1載體介導(dǎo)hSPINK1在小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期高效表達(dá)
2. rAAV8-hSPINK1在減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AP程度促進(jìn)胰腺恢復(fù)
雨蛙素是一種膽囊收縮素的類似物，促進(jìn)胰蛋白酶的激活，被廣泛用于誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性胰腺炎。為模擬CP急性發(fā)作，研究者構(gòu)建雨蛙素誘導(dǎo)急性胰腺炎（AP）模型；與對(duì)照組相比，AAV8-hSPINK1組在注射后8周內(nèi)，胰/重比、血淀粉酶、胰酶活性、自噬凋亡指標(biāo)均顯著較低，僅對(duì)高于250μg/kg雨蛙素敏感，且加速胰腺組織急性期恢復(fù)。
圖2 AAV8-hSPINK1載體減輕雨蛙素誘導(dǎo)模型的急性胰腺炎程度
3. rAAV8-hSPINK1可改善雨蛙素誘導(dǎo)的CP模型
為了評(píng)估AAV8-hSPINK1在預(yù)防CP進(jìn)展中的有效性，研究者通過雨蛙素反復(fù)注射構(gòu)建CP模型，發(fā)現(xiàn)AAV8-hSPINK1組形態(tài)學(xué)改變不顯著，纖維化水平及腺泡-導(dǎo)管化生指標(biāo)較對(duì)照組顯著下調(diào)，且終止雨蛙素刺激后胰腺組織損傷修復(fù)更快。
圖3 AAV8-hSPINK1載體減輕雨蛙素誘導(dǎo)模型的慢性胰腺炎程度
4. rAAV8-hSPINK1可減輕胰管結(jié)扎模型的炎癥和纖維化
為模擬臨床上胰管梗阻性胰腺炎，研究者構(gòu)建胰膽管結(jié)扎急性胰腺炎模型；在對(duì)照組中胰腺組織大體表現(xiàn)為明顯水腫、出血，病理學(xué)可見腺泡細(xì)胞大量壞死、大量炎細(xì)胞浸潤，而AAV8-hSPINK1組胰/重比、胰腺大體與病理指標(biāo)均顯著改善。隨后研究者于小鼠胰腺胃葉進(jìn)行結(jié)扎，模擬臨床胰管結(jié)石梗阻，于術(shù)后第四周取樣觀察，發(fā)現(xiàn)生理鹽水注射組結(jié)扎遠(yuǎn)端胰腺明顯萎縮，腺泡細(xì)胞大量丟失，胰腺脂肪沉積，而AAV8-hSPINK1組胰腺病理表現(xiàn)均較輕。
圖4 AAV8-hSPINK1治療減輕胰管結(jié)扎誘導(dǎo)的纖維化
5. rAAV8-hSPINK1改善Spink1突變小鼠胰腺病理改變和胰腺炎易感性
研究者團(tuán)隊(duì)前期通過CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建模擬人突變位點(diǎn)的Spink1 c.194+2T>C小鼠，純合小鼠（Spink1-/-）出生后致死，雜合小鼠（Spink1+/-）在出生后第14周部分自發(fā)胰腺損傷（33.3%）及纖維化（16.7%）；在Spink1+/-小鼠出生后第10周給予AAV8-hSPINK1，第14周觀察未見胰腺自發(fā)損傷及纖維化（0.0%，n=12），顯著改善Spink1+/-病理表型，增加對(duì)雨蛙素的敏感性。
圖5 AAV8-hSPINK1載體阻止Spink1+/-小鼠自發(fā)胰腺損傷及增加其對(duì)雨蛙素的敏感性
結(jié)論
本研究首次證明AAV8-hSPINK1介導(dǎo)的基因治療胰腺炎具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性。使用衣殼優(yōu)化的AAV8載體攜帶hSPINK1特異性安全靶向胰腺，對(duì)心、肺、脾、肝、腎的器官趨向性低，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高(最佳表達(dá)劑量為2E+11vg/只)。hSPINK1的表達(dá)和療效在注射后4周達(dá)到峰值，并保持顯著水平至少8周。在所有三種小鼠模型中，發(fā)病前單劑量AAV8-hSPINK1顯著減輕了胰腺炎的嚴(yán)重程度，減緩了纖維化的進(jìn)展，降低了胰腺細(xì)胞凋亡和自噬水平，加速了胰腺炎的恢復(fù)過程。一次性注射AAV8-hSPINK1安全靶向胰腺，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，可有效改善小鼠胰腺炎表型。該方法在預(yù)防和治療CP方面具有廣闊的前景。
圖6 AAV8-hSPINK1介導(dǎo)的三種小鼠胰腺炎基因治療綜述
該研究在上海長(zhǎng)海醫(yī)院/上海市胰腺疾病研究所/免疫與炎癥全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室單位完成,項(xiàng)目得到國家自然科學(xué)基金委、上海市教委科技創(chuàng)新計(jì)劃、上海市衛(wèi)生健康委員會(huì)重中之重研究中心等項(xiàng)目資助。
原文鏈接：https://gut.bmj.com/content/early/2024/03/29/gutjnl-2023-330788
九游會(huì)j9生物有幸為研究人員提供實(shí)驗(yàn)中的衣殼優(yōu)化的rAAV8載體構(gòu)建服務(wù)，用實(shí)際行動(dòng)助力基礎(chǔ)科學(xué)研究到臨床轉(zhuǎn)化！
