時(shí)間：2023-05-23 熱度：

基因表達(dá)調(diào)控是生物體內(nèi)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)控制，在疾病研究領(lǐng)域，基因表達(dá)調(diào)控幾乎是所有生物學(xué)過(guò)程的基礎(chǔ)。細(xì)胞水平上對(duì)目的基因的導(dǎo)入方式根據(jù)基因調(diào)控的時(shí)間長(zhǎng)短可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)中多會(huì)選擇穩(wěn)轉(zhuǎn)的方式構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，避免瞬轉(zhuǎn)效率不同以及瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞傳代過(guò)程中目的基因丟失等原因?qū)?shí)驗(yàn)造成誤差。

01

穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染原理：特定基因或干擾特定基因的序列整合至宿主的基因組染色體中，不會(huì)隨著細(xì)胞的增殖分裂而消失，在宿主細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)目的序列。通常，人們借助慢病毒能夠整合序列到宿主基因組的能力來(lái)完成基因的穩(wěn)定表達(dá)或穩(wěn)定干擾。

 

構(gòu)建穩(wěn)定株步驟如下（以Saos-2細(xì)胞為例）：

1) 細(xì)胞鋪板

將Saos-2細(xì)胞按30%匯合度接種到6孔板：

① Saos-2細(xì)胞配成2.0×10⁵cells/mL細(xì)胞懸液，待鋪板。

② 每孔鋪2mL，即4×10⁵cells/well，鋪1個(gè)6孔板。

2) 感染慢病毒

細(xì)胞鋪板后12-20h感染病毒

① 加病毒量計(jì)算方法：（細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×10³=病毒用量（μL）

②加polybrene：細(xì)胞樣品中polybrene終濃度為5μg/mL。

③ 病毒感染12-20h后換培養(yǎng)基：棄去培養(yǎng)基，每孔加入2mL新鮮的培養(yǎng)基。

3) 穩(wěn)定株篩選

① 72h以后，加入終濃度2μg/mL puromycin。每隔2-3d換一次終濃度2μg/mL puromycin新鮮培養(yǎng)基。

② 藥物篩選約兩周后，拍熒光照片。

③ 穩(wěn)定細(xì)胞株鑒定和凍存。

注：其他細(xì)胞的polybrene濃度及抗生素濃度需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定。

  

02

不同基因調(diào)控策略的選擇

基因表達(dá)的調(diào)控可在多個(gè)層面上進(jìn)行，包括基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平的調(diào)控，九游會(huì)j9日常提及的基因調(diào)控多指基因及轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)和下調(diào)?；虻纳险{(diào)又可分為外源過(guò)表達(dá)和內(nèi)源性激活CRISPRa（如表一），當(dāng)目的基因序列過(guò)長(zhǎng)，載體容量受限時(shí)多會(huì)選擇內(nèi)源性激活的方式實(shí)現(xiàn)目的基因上調(diào)。CRISPRa是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，突變Cas9蛋白切割DNA的活性位點(diǎn),使Cas9蛋白喪失切割DNA功能但依然保留與DNA結(jié)合的能力——稱之為“d-Cas9”，d-Cas9連接激活元件（VP64）通過(guò)gRNA引導(dǎo)至目的基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，便可實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)錄激活。

 

表一：外源過(guò)表達(dá)與內(nèi)源性激活的區(qū)別

 

基因的下調(diào)一般都會(huì)采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，利用雙鏈RNA（dsRNA）高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)。但RNAi技術(shù)對(duì)靶基因的消除是不完全的，若想完全消除需要借助CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因的敲除，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇RNAi或是基因敲除（如表二）。

 

表二：基因沉默兩種方式比較

 

基因下調(diào)也可以選擇內(nèi)源性抑制CRISPRi策略，與CRISPRa的原理相似，“d-Cas9”與基因抑制結(jié)構(gòu)域（KRAB結(jié)構(gòu)域）融合表達(dá)，通過(guò)gRNA的引導(dǎo)可實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)錄抑制。CRISPRi策略的優(yōu)勢(shì)在于可以不改變內(nèi)源基因組序列、有較高水平的基因抑制效果、特異性更強(qiáng)且適用編碼或非編碼等多種類型的基因。

 

選擇合適的基因調(diào)控策略，借助慢病毒載體整合基因的能力，快來(lái)構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株吧！小編精心整理了九游會(huì)j9客戶應(yīng)用不同調(diào)控基因策略的研究成果，以期為科研人er提供新的研究思路！

  

03

九游會(huì)j9客戶案例分享

1) 過(guò)表達(dá)＆干擾

文章標(biāo)題：Hypoxia-induced circRNF13 promotes the progression and glycolysis of pancreatic cancer

研究?jī)?nèi)容：糖酵解（胰腺癌）

發(fā)表期刊：Exp Mol Med. IF：12.153

細(xì)胞類型：SW-1990（過(guò)表達(dá)circRNF13）/MIA PaCa-2（干擾circRNF13）

載體信息：pGLV31H1-Luci-circRNF13-OE/LV-shcircRNF13/LV-NC

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或穩(wěn)定敲低circRNF13會(huì)正向調(diào)控PC細(xì)胞增殖(圖A-D)。穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建腫瘤異種移植模型來(lái)驗(yàn)證circRNF13在體內(nèi)的作用。結(jié)果顯示，circRNF13過(guò)表達(dá)顯著加速腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤體積和最終腫瘤重量顯著增加(圖E-H)，而circRNF13敲低組的腫瘤體積和重量低于對(duì)照組(圖I-L)。皮下腫瘤組織的免疫組織結(jié)果表明，Ki-67在circRNF13過(guò)表達(dá)腫瘤中的表達(dá)高于對(duì)照腫瘤(圖M)。同時(shí)CD31（血管生成的生物標(biāo)志物）陽(yáng)性細(xì)胞在circRNF13過(guò)表達(dá)的腫瘤中的百分比高于對(duì)照腫瘤(圖M)。在circRNF13敲低的腫瘤中的結(jié)果與之相反。為了進(jìn)一步確定circRNF13在PC血管生成中的功能，過(guò)表達(dá)circRNF13  SW-1990細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的管形成。相應(yīng)地，敲低circRNF13 MIA PaCa-2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在很大程度上損害了血管生成能力(圖N)。綜上所述， circRNF13在PC增殖和血管生成中起重要作用。

圖1. CircRNF13在體外和體內(nèi)促進(jìn)PC增殖和血管生成

 

2) 內(nèi)源性激活

文章標(biāo)題：PTENα and PTENβ promote carcinogenesis through WDR5 and H3K4 trimethylation

研究?jī)?nèi)容：腫瘤發(fā)生機(jī)制

發(fā)表期刊：Nat Cell Biol. IF：28.231

細(xì)胞類型：293T（內(nèi)源性激活USP9X）

載體信息：LV-dCas9-Puro，LV-gRNA（USP9X/WDR5/PTEN3/PTENα/β）

對(duì)50例肝癌患者的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PTENα/β與PTEN蛋白在肝癌中的表達(dá)不一致。與癌旁組織相比，在一些PTEN減少的腫瘤組織中，PTENα/β的表達(dá)保持不變，甚至增加(圖A，B)。PTENα和PTENβ對(duì)蛋白酶體介導(dǎo)的降解較PTEN更敏感。研究通過(guò)優(yōu)化電泳策略分離PTENα和PTENβ，發(fā)現(xiàn)PTENα和PTENβ都比PTEN更不穩(wěn)定(圖C)，蛋白酶體抑制劑MG132和PS341相較于溶酶體抑制劑NH4Cl或Brefeldin A顯著積累了PTENα/β (圖D)。Co-IP結(jié)合LC−MS/MS鑒定了3個(gè)E3連接酶或去泛素化酶(USP9X、USP7和TRIM28) 和PTENα相互作用的蛋白。通過(guò)干擾（shRNA）或敲除（CRISPR-Cas9）技術(shù)下調(diào)USP19在293T和Hela細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性PTENα/β的降低，而不影響PTEN的表達(dá)（圖E-G）。相反的是，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)USP9X和通過(guò)CRISPR-dCas9對(duì)USP9X進(jìn)行的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄激活均增加了293T細(xì)胞中的PTENα/β(圖H,I)，但未增加PTEN蛋白。綜上，USP9X正向調(diào)節(jié)PTENα/β，但不調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達(dá)。

圖2. PTENα和PTENβ在肝癌中的表達(dá)與PTEN蛋白不一致，且受USP9X的調(diào)控

 

3) 內(nèi)源性抑制

文章標(biāo)題：Human forebrain organoids-based multi-omics analyses reveal PCCB's regulation on GABAergic system contributing to schizophrenia

研究?jī)?nèi)容：精神分裂多組學(xué)分析

發(fā)表期刊：Research Square.

細(xì)胞類型：hiPSCs（內(nèi)源性抑制PCCB）

載體信息：pLV-hU6-sgRNA-hUbC-dCas9-KRAB-T2a-Puro

PCCB編碼丙酰輔酶a羧化酶的β亞基參與丙酰輔酶a28分解代謝的線粒體酶，PCCB突變可通過(guò)破壞三羧酸(TCA)循環(huán)來(lái)?yè)p害線粒體能量代謝。用PCCB穩(wěn)定敲低的hiPSCs或?qū)φ説iPSCs產(chǎn)生的hFOs（Forebrain Organoid，大腦類器官）來(lái)研究敲低PCCB對(duì)功能的影響。結(jié)果顯示，在細(xì)胞氧化磷酸化中起作用的幾個(gè)線粒體基因MT-ND2、MT-ND5和MT-CYB，在PCCB-G1和PCCB-G2 hFOs中均下調(diào)(圖A)。同時(shí)，PCCB敲低降低了hFOs中的ATP生成，增加了ROS水平(圖B,C)，引起線粒體功能障礙。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)PCCB敲低降低了琥珀酰輔酶a (SCOA)和α-KG(圖D,E)，當(dāng)在hFOs的培養(yǎng)基中添加可轉(zhuǎn)化為GABA的上游代謝物α-KG (10 μg/ml)，發(fā)現(xiàn)在PCCB敲低的hFOs中GABA水平恢復(fù)(圖F)。研究表明，PCCB敲低通過(guò)減少TCA循環(huán)降低GABA水平(圖G)。

圖3. 敲低PCCB導(dǎo)致hFOs線粒體功能障礙

 

4) 單克隆敲除

文章標(biāo)題：FBXO22 promotes leukemogenesis by targeting BACH1 in MLL-rearranged acute myeloid leukemia

研究?jī)?nèi)容：白血病

發(fā)表期刊：J Hematol Oncol. IF：23.168

細(xì)胞類型：THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（敲除FBXO22）

載體信息：pLenti-U6-gRNA-mCMV-SaCas9-P2A-sfGFP（gFBXO22）

為了研究Fbxo22缺陷抑制AML進(jìn)展的分子機(jī)制，通過(guò)免疫共沉淀(IP)結(jié)合LC-MS/MS分析探討了Fbxo22在THP-1細(xì)胞中的相互作用。關(guān)注到氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子BACH1為THP-1細(xì)胞中與FBXO22相互作用蛋白豐度最高的蛋白(圖A)。在THP-1細(xì)胞中可以檢測(cè)到內(nèi)源性BACH1與FBXO22的相互作用(圖B,C)。THP-1細(xì)胞用CRISPR/Cas9敲除FBXO22后構(gòu)建單克隆株，發(fā)現(xiàn)BACH1的蛋白水平顯著升高；shRNA敲低FBXO22使THP-1和MV4-11細(xì)胞中的BACH1穩(wěn)定；并證實(shí)BACH1蛋白的增加與抑制BACH1的HO-1蛋白的減少相關(guān)（圖D-F）。與此相反的是在THP-1細(xì)胞中，異位表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)FBXO22顯著降低BACH1蛋白和/或增加HO-1的表達(dá)(圖G, H)。此外，放射線己酰亞胺(CHX)處理FBXO22敲除的THP-1細(xì)胞中BACH1蛋白的降低被顯著阻斷(圖I)。進(jìn)一步驗(yàn)證FBXO22是否通過(guò)蛋白酶體途徑降解BACH1，顯示，F(xiàn)BXO22的表達(dá)顯著降低了BACH1蛋白的表達(dá)，而B(niǎo)FA和NH4Cl對(duì)該作用無(wú)明顯影響，這表明FBXO22介導(dǎo)的BACH1降解受到蛋白酶體和CRL復(fù)合物調(diào)控（圖L），并且FBXO22增加內(nèi)源性BACH1蛋白的泛素結(jié)合物的豐度，反之FBXO22敲除降低了THP-1細(xì)胞內(nèi)源性BACH1泛素化(圖M,N)。這些結(jié)果表明，在MLLr AML細(xì)胞中，F(xiàn)BXO22與BACH1相互作用并促進(jìn)BACH1的降解。

圖4. FBXO22在MLLr AML細(xì)胞中促進(jìn)BACH1的降解

 

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