時(shí)間：2022-09-01 熱度：

 

癲癇（Epilepsy）是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響到全球大約5000萬人。癲癇發(fā)作是由于大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常同步化放電，導(dǎo)致正常腦功能中斷，臨床表癥為反復(fù)不自主發(fā)作，身體某一部位或整個(gè)身體短暫非自主性抽搐，有時(shí)伴有意識(shí)喪失和尿便失禁。

目前，臨床上多采用抗癲癇藥物控制癲癇發(fā)作，然而有近1/3的癲癇患者癥狀難以被抗癲癇藥物控制，且藥物難治率在以海馬、杏仁核等區(qū)域起源的顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）中甚至可達(dá)70%。TLE發(fā)作機(jī)制復(fù)雜，近年來，越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為癲癇發(fā)作是關(guān)鍵腦區(qū)的功能異常導(dǎo)致神經(jīng)環(huán)路水平上“興奮-抑制”失衡的結(jié)果，因此解析TLE中精準(zhǔn)環(huán)路機(jī)制對(duì)治療癲癇至關(guān)重要。

 

2022年8月25日，浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳忠教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志在線發(fā)表了題為“Discrete Subicular Circuits Control Generalization of Hippocampal Seizures”的研究論文，研究首次揭示了海馬下托（Subiculum, Sub）存在結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性的神經(jīng)亞群，Sub深層谷氨酸能神經(jīng)元投射到丘腦前核（anterior nucleus of thalamus, ANT）的神經(jīng)環(huán)路參與TLE發(fā)展，其通過SUB-ANT中超極化激活的陽離子門控通道（HCN）介導(dǎo)的簇狀放電增強(qiáng)了TLE的形成和泛化。該研究找到了一條特異性介導(dǎo)顳葉癲癇發(fā)作的神經(jīng)環(huán)路，為臨床精準(zhǔn)治療癲癇發(fā)作及其干預(yù)分子靶點(diǎn)提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

 

 

結(jié)果

01 Sub錐體神經(jīng)元雙向調(diào)控海馬癲癇發(fā)作

首先，研究者借助鈣離子成像技術(shù)觀察海馬癲癇發(fā)作時(shí)錐體神經(jīng)元的功能變化，將AAV- CaMKIIα-Gcamp6s病毒注射于海馬下托（Subiculum, Sub），并埋入光纖。發(fā)現(xiàn)在局灶性癲癇發(fā)作（focal seizure, FS）和繼發(fā)全身性癲癇發(fā)作（Secondary generalized seizure, sGS）期間海馬下托錐體神經(jīng)元活動(dòng)增加（圖1a-c）。c-Fos結(jié)果顯示，大部分被激活的神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元，且激活的模式存在下托亞區(qū)特異性，主要集中在下托的深層（圖1f,g）。

 

隨后，研究者將AAV-CaMKIIα-hChR2-EYFP和AAV-CaMKIIα-ArchT-EGFP分別注射于WT小鼠海馬下托區(qū)（圖1h），在電點(diǎn)燃癲癇發(fā)作模型中，光遺傳激活下托錐體神經(jīng)元促進(jìn)了癲癇行為發(fā)作等級(jí)、延長(zhǎng)后放電時(shí)程（after-discharge durations, ADD）并減少了到達(dá)sGS所需電刺激次數(shù)；抑制下托錐體神經(jīng)元?jiǎng)t減弱癲癇發(fā)作并縮短ADD，且增加了達(dá)到FS和sGS所需的電刺激次數(shù)（圖1i-k）。提示了下托錐體神經(jīng)元對(duì)海馬癲癇發(fā)作具有雙向調(diào)控作用。

 

圖1 Sub錐體神經(jīng)元雙向調(diào)控海馬癲癇發(fā)作

 

02  SUB-ANT谷氨酸能投射環(huán)路雙向調(diào)控顳葉癲癇發(fā)作

進(jìn)一步，借助病毒載體示蹤技術(shù)及c-Fos染色發(fā)現(xiàn)，下托的谷氨酸神經(jīng)元向丘腦前核（anterior nucleus of thalamus, ANT）投射，為驗(yàn)證該通路在海馬癲癇發(fā)作過程中的作用，研究者在小鼠SUB區(qū)注射AAV-CaMKIIα-hChR2-EYFP，并在ANT埋入光纖（圖2a）。發(fā)現(xiàn)光遺傳激活SUB-ANT投射通路可促進(jìn)海馬癲癇發(fā)作等級(jí)并延長(zhǎng)完全點(diǎn)燃狀態(tài)下sGS的后放電時(shí)程和總時(shí)長(zhǎng)（圖2b-f）。此外，借助光遺傳學(xué)抑制SUB-ANT投射通路可延緩海馬癲癇發(fā)作等級(jí)，縮短sGS的ADD和全面性發(fā)作時(shí)長(zhǎng)（GSD）（圖2i-n），這些結(jié)果提示了，海馬下托的谷氨酸神經(jīng)元向丘腦前核的投射通路雙向調(diào)控顳葉癲癇的發(fā)作。

 

圖2 Sub谷氨酸神經(jīng)元向ANT的投射通路雙向調(diào)控顳葉癲癇發(fā)作

 

03  SUB-ANT和SUB-EC環(huán)路對(duì)海馬癲癇發(fā)作產(chǎn)生相反的作用

研究者繼續(xù)對(duì)Sub其他下游投射區(qū)域（EC：entorhinal cortex 內(nèi)嗅皮層, NAc：nucleus accumbens 伏隔核, MMB：mammillary bodies 乳頭體）進(jìn)行研究，借助光遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，抑制SUB-EC投射通路時(shí)可促進(jìn)海馬癲癇發(fā)作（圖3）。

 

圖3 SUB-EC、SUB-MMB和SUB-NAc環(huán)路在癲癇發(fā)作中發(fā)揮不同的作用

 

接下來，研究者通過向WT小鼠海馬CA1注射海人酸（Kainic acid, KA）誘導(dǎo)慢性自發(fā)顳葉癲癇模型做進(jìn)一步驗(yàn)證，作者將AAV-CaMKIIα-hM4Di-mcherry注射小鼠海馬下托，并在ANT或EC埋入套管以精準(zhǔn)給予CNO藥物（圖4a,b）。發(fā)現(xiàn)借助化學(xué)遺傳學(xué)抑制Sub-ANT通路可緩解癲癇發(fā)作；而抑制Sub-EC通路則促進(jìn)癲癇發(fā)作。

 

圖4 SUB-ANT和SUB-EC環(huán)路在KA誘導(dǎo)慢性TLE發(fā)作中產(chǎn)生相反的作用

 

基于上述結(jié)果，研究者借助逆標(biāo)染料標(biāo)記發(fā)現(xiàn)Sub深層的谷氨酸能神經(jīng)元投射到ANT；Sub淺層的谷氨酸能神經(jīng)元投射到EC（圖5a-d）。隨后，通過特異在谷氨酸能神經(jīng)元軸突末端表達(dá)GCaMP6元件發(fā)現(xiàn)，在FSs和sGSs期間，Sub-ANT的鈣信號(hào)強(qiáng)度增加；Sub-EC的鈣信號(hào)熒光強(qiáng)度減弱（sGSs期間先短暫增加后降低），提示了海馬下托兩個(gè)不同的錐體神經(jīng)元亞群通過不同的投射模式對(duì)海馬癲癇發(fā)作發(fā)揮相反的作用（圖5e-n）。

 

圖5 SUB-ANT和SUB-EC環(huán)路對(duì)海馬癲癇發(fā)作產(chǎn)生相反的作用

 

04  SUB-ANT中HCN通過調(diào)控突觸可塑性促進(jìn)海馬癲癇發(fā)作

通過電生理記錄發(fā)現(xiàn)，投射到ANT的Sub谷氨酸能神經(jīng)元存在超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation, HCN）通道功能和更強(qiáng)的神經(jīng)元簇狀放電能力，阻斷HCN通道在點(diǎn)燃模型中可顯著緩解癲癇發(fā)作等級(jí)（圖6a,b）。

 

HCN1亞型是嚙齒類動(dòng)物下托中表達(dá)最豐富的一種HCN通道亞型，因此作者研究了選擇性敲除投射到ANT或EC的Sub錐體神經(jīng)元中HCN1是否會(huì)影響神經(jīng)元放電及海馬癲癇發(fā)作，將Cav2-Cre注射到WT小鼠ANT或EC中，AAV-EF1α-DIO-miR30shRNA(Hcn1)-mCherry注射到Sub區(qū)（圖6c），發(fā)現(xiàn)在海馬電點(diǎn)燃癲癇發(fā)作模型中，選擇性下調(diào)Sub-ANT神經(jīng)元中HCN1的表達(dá)可緩解癲癇發(fā)作（圖6）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SUB-ANT中HCN通道通過調(diào)控突觸可塑性促進(jìn)海馬癲癇發(fā)生。這些結(jié)果提示了SUB-ANT存在HCN通道促進(jìn)的簇狀放電能力，從而增強(qiáng)了顳葉癲癇的形成和泛化。

 

圖6 SUB-ANT中HCN通道通過調(diào)控突觸可塑性促進(jìn)海馬癲癇發(fā)生

 

結(jié)論

本文利用經(jīng)典的小鼠顳葉癲癇模型，配合鈣離子成像、光遺傳技術(shù)、化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)、病毒示蹤技術(shù)、電生理記錄等多種技術(shù)手段首次證明了海馬下托存在結(jié)構(gòu)和功能異質(zhì)性的神經(jīng)亞群，不同亞區(qū)的神經(jīng)元通過不同的投射下游對(duì)顳葉癲癇中的“興奮-抑制”平衡調(diào)控產(chǎn)生差異化（甚至相反）的作用，其中Sub深層谷氨酸能神經(jīng)元投射到ANT的神經(jīng)環(huán)路參與海馬癲癇發(fā)作，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SUB-ANT中HCN介導(dǎo)的簇狀放電增強(qiáng)了癲癇的形成和泛化。該研究找到了一條特異性介導(dǎo)顳葉癲癇發(fā)作的神經(jīng)環(huán)路，為臨床精準(zhǔn)治療癲癇發(fā)作及其干預(yù)分子靶點(diǎn)提供了強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

該研究的第一作者為浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院博士后費(fèi)凡，浙江大學(xué)的碩士研究生王霞及浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院的徐層林研究員為共同第一作者。陳忠教授、汪儀研究員和徐層林研究員為本文的共同通訊作者。研究受到了國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)青項(xiàng)目、浙江省自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目等的資助。
 

  九游會(huì)j9生物有幸為研究者提供實(shí)驗(yàn)中使用的AAV載體，助力神經(jīng)科學(xué)研究！ 

AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6(s)	AAV2/8-CaMKIIα-hChR2-eYFP
AAV2/9-CaMKIIα-ArchT-eGFP	AAV2/9-CaMKIIα-eGFP
AAV2/9-CaMKIIα-hM4Di-mCherry	AAV2/9-CaMKIIα-mCherry
AAV2/9-EF1α-DIO-miR30shRNA (Hcn1)-mCherry