時間：2022-07-25 熱度：

 

 恐懼記憶是生物體適應(yīng)復雜生存環(huán)境的保護性機制之一。然而，過度的、不合理的恐懼記憶對機體卻是極其有害的，是導致抑郁癥、焦慮癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等重大情感和精神障礙的首要因素。作為生物體進化出的靈活應(yīng)對恐懼記憶的重要機制，消退訓練（Extinction）是通過形成新的消退記憶用以對抗固有恐懼記憶的認知過程。消退記憶是機體通過調(diào)整學習行為以適應(yīng)復雜環(huán)境變化的生理基。哂屑匾睦礪酆拖質(zhì)狄庖?，F(xiàn)有的恐懼記憶消退策略是從認知層面減低恐懼情緒，是當前相關(guān)神經(jīng)精神疾病治療的主要治療手段，然而這種方法并不能完全消除恐懼記憶：新形成的消退記憶容易遺忘或丟失，導致固有的恐懼記憶再次出現(xiàn)（記憶重現(xiàn), Renewal）或自發(fā)恢復（Spontaneous recovery）。 

恐懼記憶重現(xiàn)會進一步滋生絕望情緒甚至引起重度抑郁乃至自殺。因此，恐懼記憶消退-重現(xiàn)轉(zhuǎn)換的神經(jīng)環(huán)路和分子機制，是腦認知和腦疾病研究前沿的重大“痛點”問題。針對這一問題，2021年徐天樂團隊發(fā)表于National Science Review雜志的論文揭示了恐懼記憶消退-重現(xiàn)轉(zhuǎn)換的場景依賴性以及感覺輸入聯(lián)合性的突觸整合規(guī)律，為制定針對抑郁癥、焦慮癥等神經(jīng)精神疾病的新型干預策略提供了科學依據(jù)。另一方面，解析恐懼消退形成新記憶的大腦物質(zhì)基。袒思且浯媧⒑投澩锏幕竟媛桑囁梢暈喙厴窬竇膊≈瘟鋪峁┯行侄。
 

 2022年7月8日，復旦大學腦科學轉(zhuǎn)化研究院李偉廣研究員、上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院徐天樂教授團隊和國家兒童醫(yī)學中心（上海）、上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心江帆教授團隊合作在Molecular Psychiatry雜志上發(fā)表“Dynamic tripartite construct of interregional engram circuits underlies forgetting of extinction memory”的研究論文。研究針對恐懼記憶消退過程中新形成的消退記憶，發(fā)現(xiàn)了以內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex, mPFC）為中心的消退記憶印跡神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，揭示了消退記憶印跡網(wǎng)絡(luò)的工作模型，以及跨腦區(qū)消退記憶印跡神經(jīng)連接的動態(tài)變化規(guī)律，為理解抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等神經(jīng)精神疾病治療后復發(fā)提供了科學依據(jù)。

 

 

結(jié)果

01  消退記憶印跡神經(jīng)元的分布
 

首先，作者運用聲音-電擊偶聯(lián)恐懼記憶行為學范式結(jié)合基于神經(jīng)活性細胞群靶向重組技術(shù)的記印跡細胞標記方法（FosTRAP策略）探究消退記憶的印跡細胞基礎(chǔ)。將FosTRAP2 x H2B-GFP雙轉(zhuǎn)基因小鼠給予1天的聲音-電擊偶聯(lián)恐懼學習訓練（Conditioning A），隨后小鼠接受3天的消退記憶訓練（Extinction B），并在第3天消退訓練前30 min給予小鼠4-羥基他莫西昔芬（4-OHT）處理，促使在記憶消退過程中激活的神經(jīng)元表達H2B-GFP（圖1a），結(jié)果發(fā)現(xiàn)消退記憶印跡細胞存儲在內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex, mPFC）、基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala, BLA）和腹側(cè)海馬（ventral hippocampus, vHPC）、丘腦等多個腦區(qū)（圖1b,c）。

 

上述雙轉(zhuǎn)基因小鼠接受“恐懼記憶消退測試”（ABB測試）或“恐懼記憶重現(xiàn)測試”（ABA測試）（圖1d），行為學結(jié)果顯示，恐懼重現(xiàn)測試引起小鼠更強的恐懼反應(yīng)（圖1e）且c-fos染色結(jié)果顯示恐懼記憶重現(xiàn)時伴隨著消退記憶印跡神經(jīng)元的抑制。而記憶消退時伴隨著這類神經(jīng)元的再激活（圖1f-h）。

 
圖1 消退記憶印跡神經(jīng)元的分布

 

02  消退記憶印跡細胞的雙向操縱控制消退記憶的提取
 

為研究消退記憶印跡細胞群在恐懼記憶相關(guān)行為中的調(diào)控作用，研究者在TRAP2（Fos^2A-iCreER）小鼠mPFC中注射AAV-EF1α-DIO-NpHR3.0-EGFP病毒，并埋入光纖，隨后小鼠接受恐懼記憶行為學范式（圖2a）。結(jié)果顯示，在消退記憶測試階段，借助光遺傳學技術(shù)抑制消退記憶印跡細胞群，可引起小鼠更強烈的恐懼反應(yīng)，表現(xiàn)為小鼠的木僵行為（freezing）增加（圖2b）。

 

隨后，研究者將AAV-EF1α-DIO-ChR2(E123T/T159C)-mCherry病毒注射于TRAP2小鼠mPFC中，并埋入光纖（圖2a）。發(fā)現(xiàn)光遺傳激活消退記憶印跡細胞群，可導致在恐懼記憶重現(xiàn)測試中小鼠的木僵行為明顯下降（圖2c），提示了激活這類印跡細胞群可促進恐懼記憶消退，抑制記憶重現(xiàn)。

 

同樣地，光遺傳學分別失活或激活BLA和vHPC中相關(guān)的記憶印跡細胞可抑制或促進恐懼記憶的消退（圖2d-g）。這些結(jié)果提示了，記憶消退印跡細胞對于消退記憶提取的充分必要性。
 

圖2 消退印跡細胞的雙向操縱控制消退記憶的提取

 

03  BLA→mPFC和vHPC→mPFC印跡環(huán)路介導消退記憶的提取
 

接下來，作者借助光遺傳學技術(shù)分別抑制或激活FosTRAP2 x H2B-GFP雙轉(zhuǎn)基因小鼠BLA和vHPC中消退記憶印跡細胞，恐懼記憶條件行為學范式結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLA和vHPC印跡細胞與mPFC印跡細胞之間存在定向的功能連接（圖3）。借助病毒示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，mPFC印跡神經(jīng)元接受來自于BLA印跡神經(jīng)元（BLA→mPFC）和vHPC印跡神經(jīng)元（vHPC→mPFC）的單突觸輸入（圖4a,b）。

 

圖3 BLA和vHPC印跡細胞與mPFC印跡細胞之間存在定向的功能連接

 

為直接驗證BLA、vHPC和mPFC記憶印跡細胞之間的定向突觸聯(lián)系，研究者在TRAP2小鼠mPFC注射AAV-EF1α-DIO-TetTox-EGFP病毒，BLA或vHPC注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒（圖4c）。發(fā)現(xiàn)破傷風毒素輕鏈TetTox失活mPFC印跡神經(jīng)元，光遺傳激活BLA或vHPC印跡細胞無法逆轉(zhuǎn)恐懼重現(xiàn)（圖4d,f）；在相反的方向上，阻斷BLA或vHPC的突觸傳遞，同時激活mPFC印跡神經(jīng)元則可以逆轉(zhuǎn)恐懼重現(xiàn)，促進消退記憶表達（圖4e,g）。這些結(jié)果提示了mPFC作為消退記憶印跡網(wǎng)絡(luò)的中樞，通過自下而上的傳輸模式整合來自BLA和vHPC的印跡特異性輸入，進而調(diào)控消退記憶。

 

圖4 消退記憶提取依賴于BLA→mPFC和vHPC→mPFC印跡環(huán)路

 

04  不同腦區(qū)印跡神經(jīng)元間突觸連接的動態(tài)重塑調(diào)控了消退記憶的提取
 

記憶印跡突觸的穩(wěn)定性是記憶強度維持的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，消退記憶并不穩(wěn)定，其對恐懼記憶的抑制作用會隨著時間的推移慢慢減弱，即固有恐懼記憶的復發(fā)，稱為自發(fā)恢復（spontaneous recovery）。這可能是由于消退記憶印跡細胞激活不足導致的?；诖?，研究人員借助光遺傳結(jié)合電生理策略檢測了消退訓練一個月后，BLA→mPFC印跡細胞和vHPC→mPFC印跡細胞在自發(fā)恢復時的突觸連接變化（圖5a-c）。結(jié)果顯示，與非印跡神經(jīng)元相比，BLA→mPFC和vHPC→mPFC印跡神經(jīng)元在自發(fā)恢復時配對脈沖比值（paired-pulse ratios, PPRs）明顯升高，提示了印跡神經(jīng)元突觸前遞質(zhì)釋放能力減弱，同時，經(jīng)過再次的消退訓練后，BLA→mPFC和vHPC→mPFC印跡神經(jīng)元突觸強度得以重建（圖5d,e）。通過比較AMPAR/NMDAR比值，觀察到了類似的變化，提示了自發(fā)恢復與消退記憶印跡神經(jīng)元突觸后適應(yīng)性丟失有關(guān)（圖5f,g）。此外，在相反的方向上（mPFC→BLA），無上述突觸變化（圖5h-j）。這些結(jié)果提示了，恐懼記憶自發(fā)恢復可能是由于特定方向的消退記憶印跡神經(jīng)元突觸連接強度減弱導致的。

 

圖5 消退記憶印跡連接的動態(tài)重塑

 

最后，研究者驗證印跡神經(jīng)元突觸的可逆性。借助AAV病毒載體在FosTRAP2 x H2B-GFP雙轉(zhuǎn)基因小鼠的BLA和vHPC印跡神經(jīng)元中表達ChR2，在mPFC中埋入光纖。結(jié)果顯示，借助光遺傳高頻刺激誘發(fā)LTP可抑制恐懼記憶的自發(fā)恢復，這與自發(fā)恢復前再次消退訓練的強度相當（圖6a,b）。此外，研究者借助在體光纖記錄發(fā)現(xiàn)，光誘導LTP后光刺激上游BLA和vHPC印跡神經(jīng)元可導致下游mPFC印跡神經(jīng)元活性顯著增加（圖6c-g）。這些結(jié)果提示了，BLA→mPFC和vHPC→mPFC印跡神經(jīng)元之間的突觸連接介導了消退記憶提取。

 

圖6 光控LTP增強印跡連接促進消退記憶的提取

 

結(jié)論
 

本文借助病毒載體示蹤技術(shù)、TRAP記憶印跡細胞標記技術(shù)、行為學、光遺傳學、電生理、在體光纖記錄等多種技術(shù)手段，系統(tǒng)研究了恐懼消退中形成的新記憶—消退記憶，在記憶印跡細胞群及其互相連接構(gòu)成的印跡環(huán)路和印跡網(wǎng)絡(luò)層面，揭示了消退記憶印跡神經(jīng)元的工作模式，解析了跨腦區(qū)印跡神經(jīng)連接強度的動態(tài)變化規(guī)律，為加深理解消退記憶容易遺忘或失效的行為學特征提供了最直接的神經(jīng)生物學證據(jù)。同時也為情感障礙性腦疾病尤其是難治性（易復發(fā)）抑郁癥和焦慮癥等疾病的治療提供全新思路。

上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院博士研究生谷雪和博士后吳延嬌為該論文的共同第一作者。復旦大學李偉廣研究員、上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院徐天樂教授和上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心江帆教授為該論文的共同通訊作者。 

該研究得到了科技創(chuàng)新2030 —“腦科學與類腦研究”重大項目、國家自然科學基金、上海市級科技重大專項、上海市科委重點項目、上海市教委創(chuàng)新團隊、上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學前沿研究中心原創(chuàng)探索類青年支持項目等項目的支持。該研究還得到了加拿大多倫多大學王路陽院士、美國德克薩斯大學休斯頓健康科學中心朱曦教授、上海交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院徐楠杰研究員等的合作支持。

九游會j9生物有幸為研究者提供實驗中使用的AAV病毒載體，助力神經(jīng)科學研究！