時(shí)間：2022-07-13 熱度：

 

前言
 

距離全球首例豬心臟移植手術(shù)已經(jīng)過去半年，“頂流”馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dr. Deqiang Li的研究團(tuán)隊(duì)于2022年7月在Circulation Research雜志上發(fā)表題目為“Epicardial HDAC3 promotes myocardial growth through a novel microRNA pathway”的心血管文章。該研究揭示了心臟發(fā)育中心外膜HDAC3通過抑制miR-322/miR-503來刺激Fgf9和Igf2進(jìn)而促進(jìn)致密心肌生長(zhǎng)，為闡明先天性心臟缺陷的病因和促進(jìn)心肌再生提供了新的策略和見解。

 

背景介紹
 

 先天性心臟病CHD仍是世界范圍內(nèi)最常見的出生缺陷。肌源性缺陷常與多種形式的冠心病有關(guān)。既往的研究集中在確定心肌的內(nèi)在因素來了解潛在的致病原因，而非心肌細(xì)胞的胞間通訊與調(diào)控作用被忽視。心外膜和心外膜衍生細(xì)胞能夠通過旁分泌信號(hào)串?dāng)_調(diào)節(jié)相鄰致密心肌組織的發(fā)育，又通過提供旁分泌生長(zhǎng)因子（Fgf9、Igf2）在調(diào)節(jié)心臟再生中起著關(guān)鍵的樞紐作用。

HDAC（組蛋白去乙酰化酶）3是一類HDAC家族的成員，它可以催化從組蛋白尾部賴氨酸殘基中去除乙?；?，并通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與許多生物學(xué)過程。中胚層或全基因敲除HDAC3可導(dǎo)致肌源性缺陷和早期胚胎致死，心肌中特異性的HDAC3缺失卻不會(huì)在早期心臟發(fā)育中對(duì)心臟形態(tài)表型產(chǎn)生影響，而是會(huì)損害出生后后期的心臟功能。這表明HDAC3在非肌細(xì)胞室間的功能可能對(duì)早期心肌發(fā)育至關(guān)重要。本研究旨在探尋早期心臟發(fā)育過程中，HDAC3在心外膜中的作用以及Fgf9和Igf2的表達(dá)如何受到HDACs或miRs的調(diào)控。

 

圖. The schematics of the working model
 

亮點(diǎn)要素

1、發(fā)育中的心外膜中Hdac3的表達(dá)對(duì)致密心肌生長(zhǎng)至關(guān)重要

2、HDAC3對(duì)于心外膜衍生的細(xì)胞分化和遷移是很重要的

3、miR-322和miR-503抑制Fgf9和Igf2的轉(zhuǎn)錄

4、HDAC3通過抑制miR-322和miR-503的表達(dá)來促進(jìn)Fgf9和Igf2的轉(zhuǎn)錄

研究?jī)?nèi)容
 

01
 

研究者首先構(gòu)建了心外膜特異性Hdac3敲除鼠Hdac3eko以研究心臟發(fā)育中Hdac3在心外膜中的潛在作用。對(duì)敲除Hdac3的心外膜進(jìn)行了譜系追蹤。發(fā)現(xiàn)E12.5-E16.5，epdc（心外膜衍生細(xì)胞）發(fā)生EMT遷移至致密心肌成為成纖維細(xì)胞和冠狀動(dòng)脈血管細(xì)胞。E14.5的eko心臟遷移至致密心肌的epdc比例顯著降低，這表明在Hdac3缺乏的epdc中存在潛在的EMT遷移缺陷。心外膜促進(jìn)胚胎冠狀動(dòng)脈發(fā)展，而eko心臟中冠狀動(dòng)脈血管細(xì)胞標(biāo)志物Sox17陽性細(xì)胞明顯減少，表明eko心臟中冠狀動(dòng)脈發(fā)育受損。心外膜和epdc通過胞間相互作用促進(jìn)心肌致密化生長(zhǎng)，研究者評(píng)估了胚胎期心外膜Hdac3缺陷心臟的心。珽13.5/E14.5 eko心臟的致密層明顯比對(duì)照心臟薄。又對(duì)細(xì)胞增殖/凋亡是否導(dǎo)致eko心室壁發(fā)育不良進(jìn)行驗(yàn)證，E13.5 eko小鼠致密心肌中pH3/Brdu陽性心肌細(xì)胞的百分比與對(duì)照心肌相比顯著降低，證明心臟發(fā)育中心外膜Hdac3特異性缺失導(dǎo)致心室壁發(fā)育不全。

Figure 1. Epicardial deletion of Hdac3 resulted in hypoplasia of ventricular compact wall.

 

02
 

 為了進(jìn)一步探究導(dǎo)致eko心臟室壁發(fā)育不全表型的潛在分子機(jī)制，研究者使用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建了永生化小鼠心外膜細(xì)胞（MECs）Hdac3單克隆敲除株。Hdac3敲除MECs比對(duì)照MECs生長(zhǎng)慢。又對(duì)細(xì)胞進(jìn)行批量RNA測(cè)序和基因本體分析，發(fā)現(xiàn)了1681個(gè)下調(diào)基因。GO通路分析發(fā)現(xiàn)，前14個(gè)顯著通路均參與細(xì)胞分裂。在分析下調(diào)基因中epdc分泌的生長(zhǎng)因子后，確定Fgf9和Igf2是目標(biāo)分子。驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Hdac3敲除株中Fgf9和Igf2在mRNA和蛋白水平上均降低。體內(nèi)eko心臟中Fgf9和Igf2也顯著降低。提示Fgf9和Igf2的表達(dá)下降與Hdac3缺失有關(guān)。

 
Figure 2. Hdac3 deletion resulted in downregulation of Fgf9 and Igf2.

 

03
 

研究者試圖確定Fgf9和Igf2的減少是否與心肌細(xì)胞增殖減少有關(guān)。與對(duì)照細(xì)胞EV相比，Hdac3敲除株KO上清液中Fgf9和Igf2顯著降低。又用細(xì)胞上清處理E13.5分離的原代胚胎心肌細(xì)胞。與EV上清相比，KO上清處理的pH3陽性心肌細(xì)胞百分比和心肌細(xì)胞總數(shù)顯著降低并且其減弱了心肌細(xì)胞增殖下游信號(hào)通路ERK磷酸化的激活。而在KO中補(bǔ)充Fgf9和Igf2可以修復(fù)心肌細(xì)胞增殖缺陷并使p-FGFR1/p-IGFR1活化。以上結(jié)果表明，來自心外膜細(xì)胞分泌的Fgf9和Igf2提供了驅(qū)動(dòng)心肌細(xì)胞增殖的重要線索。
 

Figure 3. Supplementation of Fgf9 or Igf2 rescues CM proliferation defects.

 

04
 

為了確定HDAC3是通過去乙酰化酶活性來誘導(dǎo)Fgf9和Igf2的表達(dá)，研究者用選擇性HDAC3去乙?；敢种苿㏑GFP966處理MECs，RGFP966處理顯著降低了Fgf9和Igf2。研究者又進(jìn)行了Rescue實(shí)驗(yàn)。慢病毒Hdac3在敲除株中重表達(dá)成功恢復(fù)了Fgf9和Igf2的表達(dá)，而去乙?；甘Щ钔蛔兟《綡dac3的重表達(dá)并不能挽救Fgf9和Igf2的表達(dá)。證明HDAC3確實(shí)是通過去乙?；富钚哉{(diào)控Fgf9和Igf2的表達(dá)。

Figure 4. HDAC3 induces the expression of Fgf9 and Igf2 dependent on its deacetylase activity.

 

05

Fgfs和Igfs的表達(dá)可被miRs調(diào)控，研究者對(duì)敲除株進(jìn)行了miR測(cè)序。通過差異表達(dá)分析及模擬結(jié)合位點(diǎn)篩選發(fā)現(xiàn)miR-322或miR-503模擬物處理顯著抑制Fgf9和Igf2的表達(dá)。通過Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-322 mimics/miR-503 mimics處理對(duì)Fgf9和Igf2表達(dá)的顯著抑制作用。又使用miR-322或miR-503模擬物處理培養(yǎng)的E13.5心肌細(xì)胞，顯著降低了pH3陽性心肌細(xì)胞的百分比，表明miR-322和miR-503抑制心肌細(xì)胞增殖。當(dāng)HDAC3的去乙酰化酶活性被RGFP966抑制時(shí)，miR-322和miR-503與敲除株中同樣顯著上調(diào)。體內(nèi)E13.5 eko心臟中也觀察到miR-322和miR-503的顯著上調(diào)。證明了miR-322、miR-503能夠抑制Fgf9、Igf2表達(dá)和心肌細(xì)胞增殖。
 

Figure 5.miR-322 and miR-503 repress the expression of Fgf9 and Igf2 and CM proliferation.

06
 

為了確定當(dāng)Hdac3被敲除或抑制時(shí)，miR-322和miR-503的上調(diào)對(duì)Fgf9和Igf2的降低有因果影響，使用miRZip慢病毒干擾miR-322或miR-503的表達(dá)，敲低miR-322或miR-503后可顯著恢復(fù)敲除株中Fgf9和Igf2的表達(dá)。以上結(jié)果表明HDAC3通過抑制miR-322和miR-503促進(jìn)Fgf9和Igf2的表達(dá)。

Figure 6. Knockdown of miR-322 or miR-503 restores the expression of Fgf9 and Igf2.

 

07
 

H3K27Ac是活性啟動(dòng)子的標(biāo)記，也是HDAC3的直接下游靶點(diǎn)。Hdac3缺失導(dǎo)致MECs中H3K27Ac顯著增加。ENCODE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-322/miR-503的啟動(dòng)子區(qū)域受表觀遺傳調(diào)控。為了確定Hdac3缺失是否會(huì)影響miR-322/miR-503啟動(dòng)子的染色質(zhì)可及性，研究者通過ChIP-qPCR研究了H3K27Ac在敲除株中的結(jié)合親和力。發(fā)現(xiàn)Hdac3缺失顯著增加了H3K27Ac與miR-322/miR-503啟動(dòng)子的結(jié)合，這表明Hdac3缺失使miR-322/miR-503啟動(dòng)子更容易被轉(zhuǎn)錄因子接近。為了明確這種染色質(zhì)可及性的增加是否會(huì)影響miR-322/miR-503啟動(dòng)子的活性，又進(jìn)行了miR-322/miR-503啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞株相比，敲除株或經(jīng)RGFP966處理后熒光素酶活性顯著增加，表明HDAC3對(duì)miR-322/miR-503啟動(dòng)子的調(diào)控同樣依賴于其去乙酰化酶活性。

Figure 7. HDAC3 represses miR-322/miR-503 promoter activity.

 

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