STTT | 南京醫(yī)科大學(xué)盧應(yīng)梅/韓峰合作揭示BOD1介導(dǎo)IV/V葉到頂核環(huán)路參與運(yùn)動(dòng)功能
共濟(jì)失調(diào)（Ataxia）是一類以運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性紊亂為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾。俅脖硐職ú教晃?、丧誓z?、吞咽?、眼球運(yùn)動(dòng)異常、肌張力受損等。小腦功能障礙是導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)發(fā)生的重要致病因素之一。
浦肯野細(xì)胞（Purkinje cell, PC）是小腦皮質(zhì)中主要的GABA能神經(jīng)元，也是從小腦皮質(zhì)發(fā)出的唯一能夠傳出沖動(dòng)的神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，小腦浦肯野神經(jīng)元變性參與共濟(jì)失調(diào)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而，參與共濟(jì)失調(diào)的特異性投射環(huán)路及其潛在的病理機(jī)制仍不清楚。
2022年6月1日，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院盧應(yīng)梅教授課題組與藥學(xué)院韓峰教授課題組合作在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志在線發(fā)表最新研究論文“BOD1 regulates the cerebellar IV/V lobe-fastigial nucleus circuit associated with motor coordination”。此項(xiàng)研究首次報(bào)道了小腦IV/V葉到小腦頂核（Fastigial Nucleus，F(xiàn)N）投射環(huán)路異常是導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)發(fā)生的重要病因之一，揭示了基于BOD1相關(guān)信號(hào)通路所導(dǎo)致的小腦IV/V葉浦肯野神經(jīng)元至其下游投射的小腦頂核谷氨酸能神經(jīng)元環(huán)路（IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+）異常在共濟(jì)失調(diào)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制。為探索預(yù)防共濟(jì)失調(diào)等相關(guān)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)調(diào)控手段及臨床治療的分子藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。
小腦IV/V葉浦肯野細(xì)胞到FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元存在單突觸投射
小腦頂核（Fastigial Nucleus，F(xiàn)N）可通過(guò)接受小腦皮質(zhì)投射或發(fā)出神經(jīng)纖維至大腦不同區(qū)域在協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用?；诖?，研究者借助病毒示蹤技術(shù)和染料示蹤技術(shù)明確小腦葉與FN之間的投射關(guān)系。
首先，作者將紅色逆行示蹤染料注射至WT小鼠FN，7天后發(fā)現(xiàn)，小腦IV/V葉到FN有投射通路（圖1a）。隨后，將順行示蹤病毒AAV-DIO-EGFP注射L7-Cre鼠（特異性在浦肯野細(xì)胞表達(dá)Cre）小腦IV/V葉，發(fā)現(xiàn)小腦IV/V葉浦肯野細(xì)胞（Purkinje cell, PC）到FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元之間的特異性投射（圖1b-e）。進(jìn)一步，作者借助逆行示蹤病毒證實(shí)了IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路（圖1f-i）。
為表征IV/V葉到FN之間的突觸連接，研究者將AAV-CaMKIIα-EGFP注射L7-Cre鼠FN，AAV-DIO-ChR2-mCherry注射IV/V葉。膜片鉗記錄顯示，光遺傳激活I(lǐng)V/V葉到FN的投射末端可導(dǎo)致FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元產(chǎn)生誘發(fā)性抑制性突觸后電流（evoked inhibitory postsynaptic currents, eIPSCs），提示了小腦IV/V葉與FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元存在單突觸投射（圖1j-m）。
圖1 IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路
特異性抑制IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路可導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)樣行為
為研究IV/V葉—FN環(huán)路在運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為中的作用，研究者在L7-Cre鼠IV/V葉注射AAV-DIO-eNpHR3.0-mCherry病毒，對(duì)腦片進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，光遺傳抑制降低了IV/V葉浦肯野細(xì)胞的放電速率（圖2a-e）。此外，多種行為學(xué)結(jié)果顯示，光遺傳抑制IV/V葉在FN的投射末端可誘發(fā)小鼠共濟(jì)失調(diào)樣行為（圖2h-k）。同時(shí)，作者借助化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了特異性抑制IV/V葉浦肯野細(xì)胞，可導(dǎo)致FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元過(guò)度激活，從而損傷小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，產(chǎn)生共濟(jì)失調(diào)樣行為。
圖2 光遺傳抑制IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路可導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)樣行為
IV/V葉浦肯野細(xì)胞BOD1缺失可導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)
為探討IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射功能異常的分子機(jī)制。研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析、GTEx（Genotype-Tissue Expression，基因型-組織表達(dá)）數(shù)據(jù)庫(kù)和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，BOD1在小腦浦肯野細(xì)胞中高表達(dá)（圖3a-e）。
接下來(lái)，作者構(gòu)建L7-Cre; BOD1f/f小鼠以確定特異性在浦肯野細(xì)胞中敲除BOD1基因?qū)矟?jì)失調(diào)的影響。經(jīng)多種行為學(xué)范式顯示，L7-Cre; BOD1f/f小鼠出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)樣表型（圖3f-m）。
圖3 特異性敲除浦肯野細(xì)胞中BOD1可導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)
進(jìn)一步，研究者借助AAV載體攜帶浦肯野細(xì)胞特異性啟動(dòng)子（AAV-L7-Cre-EGFP）條件性在小腦IV/V葉浦肯野細(xì)胞敲除BOD1，發(fā)現(xiàn)下調(diào)IV/V葉中BOD1的表達(dá)，可降低浦肯野細(xì)胞興奮性，誘發(fā)小鼠表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)相關(guān)行為障礙（圖4a-k）。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員分別在L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉注射AAV-DIO-hM3Dq-mCherry病毒，借助化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)激活浦肯野細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)CNO藥物處理后，可改善由BOD1缺陷導(dǎo)致的小鼠共濟(jì)失調(diào)樣行為（圖4l-p）。這些結(jié)果提示了，BOD1缺失影響小腦IV/V葉浦肯野細(xì)胞活性，導(dǎo)致IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射功能異常，進(jìn)而誘發(fā)小鼠共濟(jì)失調(diào)樣行為。
圖4 BOD1調(diào)控IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路
BOD1相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+異常導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)的分子機(jī)制
接下來(lái)，研究者借助稀疏標(biāo)記病毒發(fā)現(xiàn)特異性敲除IV/V葉浦肯野神經(jīng)元中BOD1可導(dǎo)致浦肯野細(xì)胞樹(shù)突棘密度和樹(shù)突分支明顯降低。為研究其機(jī)制，作者分別在L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉注射AAV-L7-EGFP，借助流式分選結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，BOD1通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突和樹(shù)突棘相關(guān)基因影響浦肯野細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)發(fā)生改變（圖5）。
圖5 BOD1通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突和樹(shù)突棘相關(guān)基因影響浦肯野細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)發(fā)生改變
最后，研究者將AAV-DIO-BOD1-mCherry注射于L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉，發(fā)現(xiàn)上調(diào)BOD1的表達(dá)可增加IV/V葉浦肯野細(xì)胞興奮性，逆轉(zhuǎn)FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元異常放電現(xiàn)象，改善浦肯野細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)和共濟(jì)失調(diào)樣行為（圖6）。
綜上，IV/V葉浦肯野細(xì)胞中BOD1缺失通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突和樹(shù)突棘相關(guān)基因?qū)е聵?shù)突棘密度和樹(shù)突分支降低，進(jìn)而引起其活性下降，并通過(guò)影響IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路，引起FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元異常放電，最終誘發(fā)共濟(jì)失調(diào)發(fā)生。
圖6 上調(diào)IV/V葉浦肯野細(xì)胞中BOD1的表達(dá)可改善小鼠共濟(jì)失調(diào)樣行為
本文借助轉(zhuǎn)基因小鼠、病毒示蹤技術(shù)、膜片鉗記錄、光遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)、多種行為學(xué)范式、Cre-Loxp系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除、轉(zhuǎn)錄組分析等多種技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)小腦IV/V葉浦肯野細(xì)胞中BOD1缺失可通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突和樹(shù)突棘相關(guān)基因?qū)е聵?shù)突棘密度和樹(shù)突分支降低，進(jìn)而引起其活性下降，并通過(guò)影響IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路，引起FN CaMKIIα陽(yáng)性神經(jīng)元異常放電，最終誘發(fā)共濟(jì)失調(diào)發(fā)生。此項(xiàng)研究找到了一條特異性介導(dǎo)共濟(jì)失調(diào)發(fā)生的神經(jīng)環(huán)路，為探索預(yù)防相關(guān)疾病的神經(jīng)調(diào)控手段及臨床治療的分子藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。
南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院劉秀秀博士為該論文的第一作者，南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院盧應(yīng)梅教授和藥學(xué)院韓峰授為共同通訊作者。
九游會(huì)j9生物有幸為研究者提供浦肯野細(xì)胞（L7）特異性啟動(dòng)子、光遺傳、化學(xué)遺傳學(xué)、Cre等AAV病毒載體，助力神經(jīng)科學(xué)研究！
