2022年5月的春風(fēng)拂面而過，不知不覺中深埋在口罩里的高材生們，就到了一年的畢業(yè)季，此時(shí)很多應(yīng)屆畢業(yè)的碩博都忙著寫文章投文章，搞的焦頭爛額，想要在畢業(yè)前的一點(diǎn)時(shí)間里做出屬于自己的學(xué)術(shù)成果。然而也有一些人，早早就拿到了文章接收函，此時(shí)正在跟自己的紅顏知己享受校園青春中最純粹的一段快樂時(shí)光。是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)不努力么？是因?yàn)榭蒲械拿舾行圆蠲?？其實(shí)都不是的，在我看來，最大的原因在于不了解腫瘤方向發(fā)文章的“套路”。
為了解決這個(gè)問題，微風(fēng)在這里選擇2022年5月發(fā)表在《CANCER GENE THERAPY》雜志，題為“CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells”的文章[1]，與大家一起共同品味腫瘤研究中的“套路”。
01 背景介紹
肝母細(xì)胞瘤是一種具有多種分化方式的惡性胚胎性腫瘤。它是由胎兒性上皮性肝母細(xì)胞，胚胎性細(xì)胞以及分化的間葉成分組成，這種疾病多發(fā)生于小兒。對于此類腫瘤，手術(shù)切除是最為有效的治療方法，如果腫瘤是單發(fā)的、瘤體較小、位置表淺且無肝外轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除可獲治愈。但是超過半數(shù)的患者在就診的時(shí)候就失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。并且肝母細(xì)胞瘤對放療和化療均不敏感，因此找尋致病進(jìn)程中的關(guān)鍵基因，克服現(xiàn)有治療方式的瓶頸顯得至關(guān)重要。
CRISPR/Cas9單克隆敲除株，是利用單鏈導(dǎo)向RNA通過堿基互補(bǔ)配對的原理靶向基因的結(jié)合位點(diǎn)，隨后Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合到與單鏈導(dǎo)向RNA形成雙鏈的基因區(qū)域進(jìn)行切割。切割形成的雙鏈DNA斷裂在細(xì)胞內(nèi)被修復(fù)，造成基因敲除的主要修復(fù)機(jī)制是非同源末端連接NHEJ，這種修復(fù)將產(chǎn)生短的核酸插入或者刪除從而導(dǎo)致基因移碼突變。目前構(gòu)建單克隆細(xì)胞株的方式主要有電轉(zhuǎn)Cas9蛋白和gRNA、瞬轉(zhuǎn)Cas9-gRNA質(zhì)粒、慢病毒侵染、轉(zhuǎn)座子構(gòu)建 4種方式，目前主流的敲除株服務(wù)公司和高校及研究所的各個(gè)課題組，主要使用的是前3種方法。
圖1.CRISPR/Cas9敲除原理[2]
02 技術(shù)思路
（1）使用CRISPR/Cas9敲除技術(shù)構(gòu)建HuH6細(xì)胞PIM6敲除單克隆細(xì)胞系，體外檢測增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲等常規(guī)功能學(xué)。
（2）使用傳統(tǒng)的RNA-seq技術(shù)，確定PIM3敲除后下游信號通路的變化。
（3）使用過表達(dá)質(zhì)粒，扭轉(zhuǎn)PIM3敲除，進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)檢測。
（4）驗(yàn)證PIM3敲除后，對于HuH6細(xì)胞干性的影響。
（5）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PIM3敲除對于HuH6細(xì)胞皮下增殖能力的影響。
03 研究內(nèi)容
作者首先通過瞬轉(zhuǎn)Cas9和gRNA表達(dá)載體的方式，構(gòu)建了HuH6 PIM3KO單克隆細(xì)胞株。并通過Western Blot鑒定敲除細(xì)胞株的PIM3表達(dá)，選擇B11、D2、E8 3個(gè)敲除單克隆進(jìn)行后續(xù)功能研究。作者分別使用了CTG法檢測細(xì)胞增殖、臺(tái)盼藍(lán)法檢測細(xì)胞存活、transwell法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力、流式檢測了細(xì)胞的周期變化。
圖2.PIM3細(xì)胞功能檢測
作者通過轉(zhuǎn)錄組測序的方式，發(fā)現(xiàn)PIM3KO后，共有746個(gè)基因發(fā)生了顯著性表達(dá)改變，其中378個(gè)差異基因上調(diào)，368個(gè)差異基因下調(diào)。通過IPA分析，PIM3KO明顯出現(xiàn)了細(xì)胞死亡和分化基因的上調(diào)。其中CCR5信號通路是下調(diào)最為明顯的，而此通路已經(jīng)明確證實(shí)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞歸巢到轉(zhuǎn)移部位來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。除此之外，發(fā)現(xiàn)了一些細(xì)胞分化通路的激活，如FXR/RXR和LXR/RXR，這也證明了PIM3具有調(diào)節(jié)肝母細(xì)胞瘤去分化的功能。
圖3.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
作者使用過表達(dá)載體，在PIM3KO的細(xì)胞中做了回復(fù)，發(fā)現(xiàn)回復(fù)PIM3基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖速度明顯增加，而遷移和侵襲能力也明顯得到了回復(fù)，證明PIM3的功能是真實(shí)可信的。
圖4.回復(fù)實(shí)驗(yàn)
由于在轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PIM3基因與細(xì)胞去分化有關(guān)，因此作者想驗(yàn)證一下PIM3基因與腫瘤干性的關(guān)系，首先文章鑒定了干性最常規(guī)的指標(biāo)CD133并通過成球?qū)嶒?yàn)證實(shí)PIM3KO后明顯降低HuH6細(xì)胞干性。同時(shí)也測定了其他干性的biomarker，例如Oct4、Nanog、Sox2、Nestin，證實(shí)了PIM3確實(shí)影響腫瘤干性。
圖5.PIM3基因影響腫瘤干性
至此，作者完成了所有體外實(shí)驗(yàn)，但是由于文章完整性的要求，又進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的檢測。首先構(gòu)建了皮下移植瘤模型，測量了生長曲線和生存曲線，并用免疫組化檢測了KI67的表達(dá)，確定了PIM3KO后，會(huì)影響腫瘤的在體增殖。
圖6.PIM3基因功能在體驗(yàn)證
總結(jié)一下，通篇文章只是證明了PIM3在肝母細(xì)胞瘤中的作用和機(jī)制這件很簡單的事情，就發(fā)表了影響因子在6分左右的文章。它值得學(xué)習(xí)的地方在于設(shè)計(jì)的套路，使用單克隆敲除株探索基因功能，使用測序發(fā)掘通路差異，最后再進(jìn)行通路檢測和回復(fù)實(shí)驗(yàn)，套路化明顯，思路直白清晰，非：鮮仕妒坎┦棵悄７攏燜俜⒈砦惱。
參考文獻(xiàn)
[1]Raoud Marayati, Laura L. Stafman et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells.Cancer Gene Ther. 2022 May ; 29(5): 558–572. doi:10.1038/s41417-021-00334-4.
[2]TianzuoZhan,NiklasRindtorff et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy.Seminars in Cancer Biology Volume 55, April 2019, Pages 106-119，doi：org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001.
