創(chuàng)傷后的心肌成纖維細胞退！退！退！
前言
2022年1月美國華盛頓大學Jennifer Davis研究團隊在Cell Stem Cell上發(fā)表題目為“MBNL1 drives dynamic transitions between fibroblasts and myofibroblasts in cardiac wound healing”的心血管研究文章，該研究發(fā)現(xiàn)心臟創(chuàng)傷后愈合過程中MBNL1能夠驅動成纖維細胞和肌成纖維細胞之間的動態(tài)轉換。該發(fā)現(xiàn)為逆轉心臟創(chuàng)傷后心肌纖維化的進程提供了新的解決思路。背景介紹
心臟疾病的核心問題是健康的心肌組織被纖維化的疤痕組織所替代。雖然創(chuàng)傷后自我修復形成的：劭煞樂剮募」Ｋ籃笮腦嗥撲，但它會引起血流動力學障礙和心律失常最終導致心臟衰竭。：鄣男緯稍從赥cf21和Pdfgra系的心臟固有成纖維細胞的動態(tài)變化，這些成纖維細胞在損傷后增殖，然后轉化為肌成纖維細胞。有研究表明，肌成纖維細胞的狀態(tài)實際上是不穩(wěn)定和可逆的，取決于前纖維性刺激后未知分子機制的運作。
MBNL（musclebind-like protein）盲肌樣蛋白家族是一類RNA結合蛋白，MBNL1通過穩(wěn)定、剪接、聚腺苷酸化和定位靶mRNA調節(jié)轉錄。有研究表明肌強直性營養(yǎng)不良以及紅細胞和肌成纖維細胞發(fā)育缺陷與MBNL1介導的創(chuàng)傷后愈合失調有關。MBNL1基因敲除的小鼠損傷后肌成纖維細胞密度和纖維化疤痕均降低。
在成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞的過程中，所需的轉錄本如血清反應因子（SRF）和鈣調神經(jīng)磷酸酶（CnA）被MBNL1穩(wěn)定或交替拼接。這些研究均表明MBNL1在促進心臟纖維化狀態(tài)和纖維化中起著重要的作用。
亮點要素
1.MBNL1調控心臟成纖維細胞終態(tài)并調節(jié)瘢痕形成和成熟
2.MBNL1調節(jié)心肌梗死誘導的心臟成纖維細胞的增殖
3.MBNL1是誘導和維持成熟的肌成纖維細胞狀態(tài)的關鍵分子
4.MBNL1能夠穩(wěn)定成纖維細胞激活（纖維化）狀態(tài)下的轉錄本
研究思路
通過批量的轉錄組測序發(fā)現(xiàn)MBNL1在激活的肌成纖維細胞中上調，并在心肌梗死修復過程中與成纖維向肌成纖維細胞狀態(tài)的轉變相符合，確定MBNL1在細胞動態(tài)轉換之間起到重要作用。（確定基因）
構建MBNL1過表達心臟成纖維細胞特異性轉基因鼠與MI模型鼠，F(xiàn)ACS分選心臟成纖維細胞并測序，發(fā)現(xiàn)MBNL1能夠使肌成纖維細胞相關的轉錄本上調。又在MBNL1過表達的基礎上構建MI模型小鼠，采用膠原及增殖熒光染色等方法，明確了MBNL1抑制MI誘導成纖維細胞增殖并穩(wěn)定：鄣淖饔。（基因up驗證）
構建MBNL1條件性敲除小鼠，通過染色及心臟超聲發(fā)現(xiàn)MBNL1缺失在心梗情況下減少纖維化及肌成纖維細胞增殖、減輕心室擴張、改善收縮功能。與對照小鼠相比，敲除小鼠成纖維細胞分化缺陷且纖維化瘢痕組織形成不良，又通過感染過表達SRF腺病毒恢復了轉化為肌成纖維細胞的能力。（基因down驗證）
對MBNL1缺失的MI小鼠心臟進行單細胞測序分析各細胞發(fā)展情況，發(fā)現(xiàn)MBNL1缺失后MI小鼠心臟重新部署了損傷后修復的體系。其中與纖維化有關的基因下調，與EMT及心外膜發(fā)育有關的上調，提示了無MBNL1在損傷后修復中的優(yōu)勢。（單細胞宏觀動態(tài)分析）
為了探究MBNL1的作用機制，對結合因子、分化誘導基因以及M基因數(shù)據(jù)庫進行挖掘。發(fā)現(xiàn)Sox9滿足條件且是EMT和肌成纖維細胞形成的必需轉錄因子并進行mRNA衰減實驗驗證。（探索機制）
研究內容
對4、14、28天的心梗小鼠肌成纖維細胞進行批量的轉錄組測序，發(fā)現(xiàn)在梗死修復過程中，肌成纖維細胞轉錄組的動態(tài)變化與成纖維細胞增殖、肌成纖維和母纖維細胞的相互轉變相符合。在損傷修復過程中，參與正常成纖維細胞功能的基因下調，與ECM相關的基因上調，細胞周期基因先高表達再下降，提示了成纖維細胞先增殖又被抑制的情況。為了比較靜止和激活的心臟成纖維細胞之間的基因表達差異，構建了它莫昔芬誘導的熒光報告轉基因小鼠標記激活的成纖維細胞。FACS分離兩種狀態(tài)的細胞并檢測，發(fā)現(xiàn)MI后postn追蹤的激活成纖維細胞中代表性肌成纖維細胞基因（Col1a1、Acta2等）顯著上調，并且MBNL1基因表達在第4天和第14天在激活的肌成纖維細胞中也升高。證明了MBNL1活性與損傷后修復的肌成纖維細胞的形成有關。
為了驗證MBNL1過表達是否能將心臟成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，研究者構建了特異性過表達MBNL1轉基因小鼠。對其心臟成纖維細胞測序分析，發(fā)現(xiàn)過表達MBNL1的小鼠成纖維細胞中上調的一些轉錄本是肌成纖維細胞的標志性基因，與梗死的對照小鼠的成纖維細胞狀態(tài)相似，這表明了MBNL1的過表達能將正常成纖維細胞誘導為心：蟪上宋赴睦嗨譜刺。雖然狀態(tài)相似，但心臟纖維化、aSMA+肌成纖維細胞數(shù)量或心臟結構功能方面差異不明顯，研究者推測需要額外的刺激來實現(xiàn)生理性肌成纖維細胞的表型。隨后應用了TGF-β處理增加aSMA+應力纖維，并聯(lián)合SRF處理增加硬度。在該過程中發(fā)現(xiàn)SRF作用于MBNL1的下游，敲低SRF會阻斷了TGF-β介導的過表達MBNL1心臟成纖維細胞的分化。
圖2.心臟成纖維細胞特異性MBNL1過表達誘導肌成纖維細胞表型
為了建立纖維化表型，對MBNL1過表達轉基因小鼠進行心肌梗死手術發(fā)現(xiàn)MI顯著上調轉基因小鼠心臟成纖維細胞中的幾個典型膠原基因。CLIP-seq結果顯示MBNL1定位在膠原和纖維連接蛋白等分泌因子上，并且在MI一段時間后過表達MBNL1的心臟瘢痕與對照組相比更成熟，可能是由于Tg心臟成纖維細胞中有關基質成熟因子（Lox和Runx1）的過表達。通過染色測量PDGFRa+、EdU+細胞的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，Tg小鼠成纖維細胞的增殖能力與對照相比顯著降低；RNA-seq分析顯示，MI后Tg心臟成纖維細胞中陽性細胞周期調控因子均下調，而細胞周期抑制因子顯著上調，可能是由于過表達MBNL1誘導了細胞凋亡或抑制傷口愈合的增殖期限制了成纖維細胞數(shù)量。這些數(shù)據(jù)表明，過表達MBNL1小鼠成纖維細胞增殖減少阻止了MBNL1表達和MI損傷對肌成纖維細胞密度和：凵傻牡加效應。
圖3.心肌成纖維細胞中過表達MBNL1可阻止MI依賴性的成纖維細胞增殖
構建MBNL1心臟成纖維特異性敲除小鼠，以檢測MBNL1對心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞狀態(tài)轉變的重要性。正常心臟成纖維細胞特異性MBNL1缺失不影響心臟功能，但在心肌梗死后，MBNL1缺失小鼠心室不擴張、收縮功能有所改善且纖維化和肌成纖維細胞密度降低了40%，表明MBNL1是肌成纖維細胞形成和纖維化所必需的。Col5a1在MBNL1缺失心臟中顯著下調且其ECM中的未成熟膠原纖維較多，膠原纖維寬度和排列也減少，表明MBNL1缺失導致MI后心臟瘢痕發(fā)育不成熟和不穩(wěn)定。由于TGF-β處理能夠模擬MI后纖維化形成aSMA+應力纖維，采用SRF腺病毒感染TGF-β處理的成纖維細胞發(fā)現(xiàn)：能夠被MBNL1穩(wěn)定的SRF可以拯救TGF-β介導的肌成纖維細胞分化。證明了MBNL1及其下游調控靶點發(fā)揮作用，成纖維細胞就能夠進行程序化狀態(tài)轉換，由此說明了MBNL1在轉換中的重要性。
圖4.MBNL1是心臟成纖維細胞狀態(tài)轉變和纖維化瘢痕形成所必需的
EMT調控基因表達的改變并不能確定是由于MBNL1在成纖維細胞轉換或心外膜重新激活中的作用。研究者對正：蚆I心臟成纖維細胞進行了單細胞RNA-seq (scRNA-seq)測序，發(fā)現(xiàn)在MBNL1缺失小鼠中，同時高度表達Sca1和Pdgfra的靜止成纖維細胞簇顯著增加，這表明MBNL1缺失的靜止成纖維細胞簇此時具備了心臟間充質干細胞的特征。而且超過一半的MBNL1缺失心臟成纖維細胞位于較大的激活肌成纖維細胞簇中，許多用于結合拼接的轉錄本均直接結合并受MBNL1調控。當MI后，MBNL1缺失將60%的心臟成纖維細胞轉化為成熟狀態(tài)，說明MBNL1與MI同時作用將靜止的成纖維細胞轉換為成熟的肌成纖維細胞狀態(tài)。心肌梗死后MBNL1功能喪失的影響更為顯著，因為整個心臟成纖維細胞群仍處于靜止狀態(tài)，所以MBNL1對于成纖維細胞的轉換起到?jīng)Q定性作用。
圖5.scRNA-seq顯示MBNL1在成纖維細胞和肌成纖維細胞之間起著轉錄后轉換的作用
為了評估MBNL1調控的轉錄本在MI后驅動心臟成纖維細胞狀態(tài)時的變化，研究者進一步挖掘了三個數(shù)據(jù)集：MBNL1結合、肌成纖維細胞分化誘導因子、以及MI后MBNL1缺失心臟成纖維細胞中下調的轉錄本。發(fā)現(xiàn)Sox9是同時滿足三個條件的關鍵性因子，它是EMT和肌成纖維細胞形成必需的轉錄因子。在MI損傷后，Sox9在野生型Postn+肌成纖維細胞中的表達增加了8.5倍，且相對于靜止的成纖維細胞，Sox9的表達仍保持升高。相反，在梗死的MBNL1缺失的心臟中，Sox9+和PDGFRa+成纖維細胞的百分比降低了2.5倍。將Sox9轉染到心臟成纖維細胞中，足以在體外誘導成aSMA+肌成纖維細胞，表明單獨Sox9可促進肌成纖維細胞狀態(tài)，并可修復MBNL1缺失的成纖維細胞分化缺陷。已有的研究表明MBNL1結合并調控Sox9，由于Sox9與MBNL1的表達同時上調，研究者推測MBNL1可以穩(wěn)定Sox9的轉錄。為了驗證這一假設，對心肌成纖維細胞進行了mRNA衰減檢測，并用腺病毒轉染MBNL1 挽救了Sox9的表達，這個操作減緩了兩個基因型介導的衰減率。這表明心肌梗死后，MBNL1穩(wěn)定心臟成纖維細胞中的Sox9轉錄本，以促進肌成纖維細胞狀態(tài)的轉變。
圖6.MBNL1穩(wěn)定Sox9并促進肌成纖維細胞的形成
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