從細(xì)胞表面受體到基因釋放，rAAV如何進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)？

時(shí)間：2022-03-30 熱度：

重組腺相關(guān)病毒

重組腺相關(guān)病毒(RecombinantAdeno-associated Virus, rAAV)是一種可以高效遞送外源基因在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的工具病毒載體，具有免疫原性低、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、無自主復(fù)制能力等多種特點(diǎn)，且擁有上百種靶向性各異的血清型，可實(shí)現(xiàn)特異組織/細(xì)胞基因遞送?；诙喾N優(yōu)點(diǎn)，rAAV被廣泛應(yīng)用于臨床前基因功能研究和人類重大疾病的基因治療，如視網(wǎng)膜疾病、血友病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心血管疾病等。數(shù)款rAAV基因治療藥物獲批臨床應(yīng)用。

目前rAAV在基礎(chǔ)研究和基因治療領(lǐng)域被大量應(yīng)用，然而對(duì)于rAAV載體在細(xì)胞水平上與宿主之間的相互作用理解仍不完全，提高這方面的認(rèn)識(shí)將有助于更精準(zhǔn)地以細(xì)胞/組織特異性的方式調(diào)控基因的表達(dá)，提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，增加臨床試驗(yàn)中rAAV基因治療的成功。

粘附與病毒進(jìn)入

rAAV感染機(jī)制的第一步是先要進(jìn)入細(xì)胞，目前微小病毒進(jìn)入細(xì)胞的方式是從衣殼結(jié)合到細(xì)胞表面的聚糖或糖復(fù)合物開始的，這促進(jìn)了衣殼與細(xì)胞表面的共受體相互作用，實(shí)現(xiàn)內(nèi)化（圖1A）。

rAAV不同血清型衣殼的特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)決定了各自聚糖受體和共受體的特異性（表1）。如AAV2，其結(jié)合以硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteo-glycan,HSPG)為主要受體，并利用整聯(lián)蛋白和生長(zhǎng)因子受體作為共受體進(jìn)入細(xì)胞。同時(shí)，全基因組篩查發(fā)現(xiàn)，跨膜蛋白KIAA0319L是rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞所必需的宿主因子，可作為幾種常見的rAAV血清型的受體，被命名為通用AAV受體(AAVR)，當(dāng)衣殼與細(xì)胞表面的聚糖結(jié)合穩(wěn)定，rAAV通過KIAA0319L依賴或非依賴的方式進(jìn)行內(nèi)化。

表一 AAV血清型特異性受體，共受體和進(jìn)入因子

內(nèi)化作用

rAAV與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而觸發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。這一過程可以依賴多種方式發(fā)生，比如有的依賴網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白，但并非都需要依賴網(wǎng)格蛋白。此外，一種小的GTP結(jié)合蛋白-RAC1在促進(jìn)病毒入胞過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，被稱為巨胞飲作用(micropinocytosis)。多項(xiàng)研究報(bào)道表明，網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白或巨胞飲作用可能在一定程度上影響rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但它們對(duì)于rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必需的（圖1B）。這提示了，多種內(nèi)化途徑可能共存，特定內(nèi)化途徑取決于宿主細(xì)胞類型、受體/共受體的特異性及rAAV血清型的不同。

病毒胞內(nèi)運(yùn)輸

rAAV進(jìn)入細(xì)胞后，進(jìn)入早期內(nèi)涵體(early endosomes, EEs)、晚期內(nèi)涵體(late endosomes, LEs)和高爾基體(Golgi)中，rAAV進(jìn)入內(nèi)涵體是病毒有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵步驟，rAAV的胞內(nèi)運(yùn)輸需要借助內(nèi)涵體的酸化過程。研究發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞類型和病毒劑量影響rAAV進(jìn)入內(nèi)涵體。

泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)會(huì)影響rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒的構(gòu)象發(fā)生變化或衣殼蛋白局部變性，導(dǎo)致病毒能被泛素化，這是病毒顆粒降解的信號(hào)。rAAV衣殼蛋白泛素化具有組織特異性，且不同rAAV血清型對(duì)泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)敏感性不同。蛋白酶體抑制劑可以提高不同rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

病毒脫殼及入核

目前對(duì)于rAAV的入核機(jī)制尚無統(tǒng)一結(jié)論，主要有兩種不同的看法：其一，rAAV在進(jìn)入細(xì)胞核之前，會(huì)從內(nèi)涵體或反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(trans-golgi network, TGN)逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，并在核周間隙處(perinuclear space)聚集，裂解，隨后DNA基因組進(jìn)入細(xì)胞核（圖1D）。其二，也有研究認(rèn)為rAAV通過核孔復(fù)合體(nuclear pore complexes, NPCs)以完整的病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并在核內(nèi)完成脫殼，而不是被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入核。

基因組釋放及表達(dá)

一旦進(jìn)入細(xì)胞核，rAAV基因組就從衣殼中釋放出來，也有可能是病毒顆粒在入核之前或期間釋放了DNA基因組。為了實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)，單鏈AAV(ssAAV)基因組可以通過互補(bǔ)鏈合成或堿基配對(duì)使正負(fù)鏈雜交的方式復(fù)制成為雙鏈DNA后表達(dá)目的基因，這一過程為rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的限速步驟，新合成的中間體dsDNA的穩(wěn)定性也是一個(gè)限制因素。

自互補(bǔ)AAV(Self-complementary AAV, scAAV)是在rAAV的基礎(chǔ)上將其編碼區(qū)域設(shè)計(jì)成雙鏈DNA，感染細(xì)胞后互補(bǔ)部分互補(bǔ)形成雙鏈DNA，不需等待第二鏈DNA合成，取消了rAAV基因表達(dá)的限速步驟，因此scAAV感染后3-5天即可到達(dá)表達(dá)高峰，同時(shí)在部分細(xì)胞中觀察到了更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

rAAV DNA基因組的釋放、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)取決于rAAV血清型和宿主細(xì)胞類型。例如，在Hela細(xì)胞中，與rAAV2和5相比，rAAV1是較快在核內(nèi)脫殼的，但由于DNA基因組釋放效率低，rAAV1的轉(zhuǎn)導(dǎo)率最低。此外，在小鼠肝臟中，rAAV2、6和8進(jìn)入細(xì)胞核并在核內(nèi)脫殼的速度類似，但rAAV6和rAAV8的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯更高。

圖1 rAAV細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

rAAV侵染細(xì)胞時(shí)，先與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而觸發(fā)AAV通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過內(nèi)涵體、高爾基體等細(xì)胞器的協(xié)助下進(jìn)入細(xì)胞核，病毒裂解釋放基因組，其單鏈DNA需復(fù)制成為雙鏈DNA后表達(dá)目的基因。

了解rAAV細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制將有助于更精準(zhǔn)地以細(xì)胞/組織特異性的方式調(diào)控基因的表達(dá)，提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，增加臨床試驗(yàn)中rAAV基因治療的成功。同時(shí)，選擇穩(wěn)定、高質(zhì)量的病毒包裝體系開展病毒制備亦對(duì)基因研究的順利進(jìn)行至關(guān)重要。

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參考文獻(xiàn)

[1]Bijay P Dhungel, Charles G Bailey, John E J Rasko., Journey to the Center of the Cell: Tracing the Path of AAV Transduction. Trends Mol Med. 2021 Feb;27(2):172-184.

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