過去幾年出現(xiàn)的幾起rAAV基因療法致死事件，均與接受高劑量rAAV有關(guān)，因此在實際研究或臨床治療中并非rAAV的劑量越高，效果就越好。研究報道，過高劑量的rAAV，隨著衣殼劑量的增加，使得對衣殼特異性T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)從而清除轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞，導(dǎo)致治療效果喪失，甚至由于嚴(yán)重的免疫反應(yīng)導(dǎo)致死亡。低劑量的rAAV有可能被anti-AAV抗體，甚至低滴度的中和抗體中和，從而導(dǎo)致效果不明顯。因此精確的rAAV滴度測定、合適的載體劑量范圍區(qū)間，是保證使用最佳效果的重要前提。

圖1 載體劑量與系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染后效果之間的關(guān)系

（Mingozzi et al., 2013）

rAAV載體的純度要求和雜質(zhì)控制是載體制備、純化、質(zhì)控過程中的重要因素，是順利開展臨床前實驗和臨床研究的先決條件。在rAAV載體制備過程中，除了含有全長DNA基因組的完整rAAV載體外，有一定比例的rAAV顆粒不含任何DNA基因組，被稱為空病毒顆粒。

大量空病毒顆粒的存在可能會影響rAAV載體的有效性和安全性，它們可能作為抗原的供應(yīng)源，引起細(xì)胞免疫毒性；亦有可能競爭細(xì)胞表面受體結(jié)合位點(diǎn)，影響轉(zhuǎn)錄效率。因此優(yōu)化生產(chǎn)工藝，探索控制空殼rAAV產(chǎn)生的辦法；建立有效純化方式，去除空殼rAAV是rAAV載體生產(chǎn)工藝重要任務(wù)，對于獲得可靠、穩(wěn)定、有效的研究數(shù)據(jù)至關(guān)重要。

圖2 九游會j9生物rAAV載體生產(chǎn)空殼率

電鏡結(jié)果：包裝DNA基因組的病毒顆粒為實心顆粒（紅色箭頭）；空病毒顆粒中間存在空洞（黃色箭頭）

隨著rAAV載體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的不斷發(fā)展，使用高質(zhì)量的rAAV載體可以為實驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性及臨床治療的安全性和有效性提供保障。

基于12年、30000+的病毒生產(chǎn)經(jīng)驗，九游會j9生物持續(xù)優(yōu)化病毒生產(chǎn)全流程，選擇GMP級的質(zhì)粒，官方授權(quán)的293T細(xì)胞完成病毒包裝。建立標(biāo)準(zhǔn)三級細(xì)胞庫，每月更換細(xì)胞，保證代次；優(yōu)化質(zhì)粒配比、病毒收獲時間，借助超離、PEG沉淀、超濾、層析等科研及工業(yè)生產(chǎn)中的整合純化工藝，持續(xù)降低rAAV載體的空病毒顆粒及內(nèi)毒素殘留，經(jīng)多次隨機(jī)檢測rAAV載體空殼率<2%、內(nèi)毒素含量均＜2.5EU/mL，遠(yuǎn)超出行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。同時，對生產(chǎn)的每批rAAV產(chǎn)品在出庫前均會進(jìn)行物理滴度測定，通過qPCR絕對定量的方式進(jìn)行基因組拷貝數(shù)測定和考馬斯亮藍(lán)染色檢測病毒衣殼蛋白，以保證產(chǎn)品的滴度準(zhǔn)確。