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藥物濫用（如可卡因、阿片類藥物）最初會帶來急性獎賞效應，即藥物的正性強化效應，用藥后導致大腦功能的適應性變化，且這種快感驅(qū)使個體進一步攝取藥物；停藥后個體會產(chǎn)生不適的身體反應以及煩躁、抑郁、易怒、焦慮等負面情緒。個體為了緩解這種不適會進一步獲藥，即負性強化效應。正性強化和負性強化的循環(huán)交替促進藥物依賴的狀態(tài)。
嗎啡（morphine）是阿片類藥物的一種。其衍生物鹽酸嗎啡是臨床上最常用的鎮(zhèn)痛劑，有極強的鎮(zhèn)痛作用。然而，嗎啡具有易成癮這一：畹母弊饔。長期使用嗎啡的患者會產(chǎn)生嚴重的依賴性，如果停止用藥一段時間，會產(chǎn)生焦慮、抑郁等戒斷反應。這些戒斷反應會驅(qū)使患者使用更多嗎啡，形成惡性循環(huán)，嚴重：α斯步】。
藥物從最初獎賞過渡到藥物依賴的過程伴隨著大腦神經(jīng)環(huán)路可塑性的改變，中腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area, VTA）神經(jīng)元可塑性參與調(diào)控阿片類藥物依賴和戒斷癥狀[1,2]，然而，目前尚不清楚影響獎賞的正性強化和戒斷誘發(fā)的負性強化之間轉(zhuǎn)換的神經(jīng)環(huán)路重塑機制。
近日，復旦大學腦科學研究院馬蘭/王菲菲團隊在Molecular Psychiatry發(fā)表題為CRHCeA→VTA inputs inhibit the positive ensembles to induce negative affect of opiate withdrawal的最新研究工作[3]。該研究借助即早基因驅(qū)動的標記技術標記了VTA中嗎啡激活的獎賞神經(jīng)元集群（嗎啡神經(jīng)元集群），發(fā)現(xiàn)中央杏仁核（central amygdala, CeA）中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）神經(jīng)元通過抑制性環(huán)路調(diào)控VTA嗎啡神經(jīng)元集群，并介導嗎啡戒斷誘發(fā)的負性強化效應，闡明了成癮性藥物嗎啡負性強化環(huán)路和分子機制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預靶點，具有重要科學和社會意義。
1.VTA嗎啡神經(jīng)元集群以多巴胺依賴機制介導正性強化
首先，研究人員借助響應神經(jīng)元活性的功能元件--E-SARE（synaptic activity-response elements， AAV-E-SARE-CreERT2）標記中腦邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area, VTA）嗎啡初次暴露激活的神經(jīng)元集群（Mor-Ens, 嗎啡神經(jīng)元集群），發(fā)現(xiàn)VTA嗎啡神經(jīng)元集群偏向性地投射到伏隔核（the nucleus accumbens, NAc）腦區(qū)（圖1a-f）。
隨后，研究人員在小鼠VTA區(qū)注射AAV-E-SARE-CreERT2和AAV-DIO-hChR2-mCherry混合病毒并埋入光纖，借助顱內(nèi)自身刺激（intracranial self-stimulation, ICSS）系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，光激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群可引起小鼠鼻觸反應次數(shù)增加，使用氟哌噻醇（flupenthixol 多巴胺拮抗劑）可抑制這一現(xiàn)象（圖1g-j）。同時，借助DA探針發(fā)現(xiàn)激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群能夠促進NAc多巴胺的釋放（圖1k-o）。
上述結(jié)果提示了VTA嗎啡神經(jīng)元集群偏向性地投射到伏隔核（NAc）腦區(qū)，激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群能夠促進NAc多巴胺的釋放，引發(fā)小鼠的自給光行為，介導了多巴胺依賴的正性強化效應。
圖1 VTA嗎啡神經(jīng)元集群以多巴胺依賴機制介導正性強化
2.VTA嗎啡神經(jīng)元集群接收的抑制性輸入增強，介導戒斷誘發(fā)的負性強化
接下來，借助全細胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，在慢性嗎啡暴露條件下，TH陽性VTA嗎啡神經(jīng)元集群的mIPSC振幅和頻率顯著增加，提示了VTA多巴胺能嗎啡神經(jīng)元集群接受更多的抑制性輸入（圖2a-i）。
隨后，借助化學遺傳學技術和行為學范式發(fā)現(xiàn)，hM4Di抑制VTA嗎啡神經(jīng)元活性會加重嗎啡戒斷誘發(fā)的條件位置厭惡和焦慮行為，而hM3Dq激活嗎啡神經(jīng)元集群能夠緩解嗎啡戒斷帶來的厭惡和焦慮負性情緒（圖2j-w），提示了編碼嗎啡獎賞的正性神經(jīng)元集群功能受到抑制，是導致嗎啡負性強化的原因。
圖2 VTA嗎啡神經(jīng)元集群接收的抑制性輸入增強，介導戒斷誘發(fā)的負性強化
3.激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負性情緒
研究發(fā)現(xiàn)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）參與戒斷期間相關行為，研究人員在CRH-Cre鼠VTA區(qū)注射 AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP，標記在中央杏仁核（central amygdala, CeA）、終紋床核（bed nucleus of stria terminalis, BNST）和下丘腦室旁核（paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN）投射到VTA的CRH神經(jīng)元。慢性嗎啡處理后，CRHCeA→VTA和CRHBNST→VTA神經(jīng)元中c-Fos表達增加（圖3a-c）。
CeA是杏仁體主要的抑制性輸出部位，參與情緒加工[4-6]。因此，研究人員借助逆行示蹤病毒和電生理技術發(fā)現(xiàn)，嗎啡慢性給藥治療增加了CRHCeA→VTA神經(jīng)元mEPSC振幅和頻率，提高了神經(jīng)元興奮性(圖3d-j)。
隨后，研究人員在CRH-Cre鼠CeA區(qū)注射Cre依賴的光遺傳學病毒，并在VTA埋入光纖，借助條件性位置厭惡（conditioned place aversion, CPA）、高架十字迷宮（elevated-plus maze, EPM）和曠場實驗（open-field, OFT）行為學范式發(fā)現(xiàn)，AAV-DIO-eNpHR3.0抑制CRHCeA→VTA投射通路可緩解嗎啡戒斷誘發(fā)的焦慮和厭惡負面情緒（3k-p），AAV-DIO-hChR2激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負性情緒（3q-v）。
圖3 激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發(fā)負性情緒
4.慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經(jīng)環(huán)路重塑
進一步，研究人員在CRH-Cre鼠VTA注射AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP和AAV-Retro-hSyn-tdTomato病毒，c-Fos共標統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)嗎啡慢性給藥增加了CeA腦區(qū)c-Fos+CRH+神經(jīng)元的比例（圖4a-c），提示了嗎啡慢性給藥對CRHCeA→VTA神經(jīng)元活性有特異性調(diào)節(jié)作用。
為研究CeA到嗎啡神經(jīng)元集群（Mor-Ens）的單突觸輸入，作者借助E-SARE元件和逆向跨突觸病毒系統(tǒng)標記VTA輸入神經(jīng)元，并用熒光探針技術發(fā)現(xiàn)CeA crh陽性神經(jīng)元偏向性地與嗎啡神經(jīng)元集群形成突觸連接（圖4d-g）。
接下來，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-mCherry，VTA區(qū)注射AAV-RAM-tTA-TRE-EGFP，借助Dox標記體系和光遺傳學技術發(fā)現(xiàn)，嗎啡慢性給藥促使CeA中CRH神經(jīng)元向VTA多巴胺能嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性連接增強（圖4h-s）。
圖4 慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經(jīng)環(huán)路重塑
5.CRHCeA→VTA通路介導嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負面情緒的產(chǎn)生
隨后，研究人員借助RAM-tTA-TRE/DOX系統(tǒng)做進一步驗證，他們在CRH-Cre小鼠VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，CNO激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群導致了小鼠焦慮樣行為（圖5a-e），這與E-SARE-CreERT2TAM系統(tǒng)得到的結(jié)果一致。
為觀察VTA嗎啡神經(jīng)元集群的激活是否能緩解由CRHCeA→VTA連接增強引起負性情緒，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-EYFP，VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，借助CPA和EPM行為學范式發(fā)現(xiàn)，光遺傳激活CRHCeA→VTA通路導致的小鼠表現(xiàn)出條件性位置厭惡，同時進入開放臂的次數(shù)減少，表現(xiàn)出焦慮樣行為，而化學遺傳激活VTA嗎啡神經(jīng)元集群則有效改善了這一現(xiàn)象（圖5f-j）。
圖5 CRHCeA→VTA通路介導嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負性情緒的產(chǎn)生
6.嗎啡神經(jīng)元集群的CRHR1受體介導CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發(fā)的負性情緒
由于光刺激可能觸發(fā)神經(jīng)元末梢的神經(jīng)肽釋放[7]。研究人員對CRH受體信號在CeA中CRH神經(jīng)元向VTA嗎啡神經(jīng)元集群抑制性輸入通路的潛在作用做進一步研究。他們在VTA離體腦片做光遺傳操作和電生理記錄，發(fā)現(xiàn)CRHR1受體拮抗劑可顯著降低VTA嗎啡神經(jīng)元集群O-IPSCs（optical-evoked inhibitory postsynaptic currents, 光誘發(fā)抑制性突觸后電流）的振幅和頻率，提示了CRHR1受體介導了CRH信號參與嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入，揭示了CRH信號通路在CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群投射通路可塑性重塑中的重要作用（圖6a-f）。
最后，研究人員探究這種神經(jīng)環(huán)路的重塑涉及的具體分子機制，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術下調(diào)CRHR1的表達，在小鼠VTA區(qū)注射AAV-sgCrhr1-mcherry, AAV-RAM-tTA-TRE-Cre和AAV-DIO-saCas9病毒，單分子熒光原位雜交技術（smFISH）發(fā)現(xiàn)，VTA嗎啡神經(jīng)元集群中Crhr1 mRNA表達顯著下調(diào)（圖6g-i）。同時，行為學范式結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRHR1缺失對于小鼠嗎啡戒斷時期的條件性位置厭惡、自發(fā)活動以及糖水偏好行為無明顯變化，但是增加了小鼠進入開放臂的次數(shù)、懸尾實驗（TST）中小鼠掙扎時間以及社交評分，提示了VTA嗎啡神經(jīng)元集群中CRHR1參與嗎啡戒斷時期包括焦慮、抑郁、社交能力下降等負性情緒的發(fā)展（圖6j-p）。
此外，在CRH-Cre小鼠注射光遺傳病毒及RAM/DOX系統(tǒng)介導的CRISPR病毒發(fā)現(xiàn)，抑制嗎啡神經(jīng)元集群上的CRHR1受體顯著降低O-IPSC振幅，提示了下調(diào)CRHR1受體的表達，能顯著減弱CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入（圖6q-s）。
綜上，CRHR1受體參與CeA CRH神經(jīng)元到VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性輸入環(huán)路的突觸和功能重塑，介導了嗎啡戒斷誘發(fā)的負性強化。
圖6 嗎啡神經(jīng)元集群的CRHR1受體介導CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發(fā)的負性情緒
本文中，作者首先借助即早基因驅(qū)動的標記技術標記了VTA中嗎啡初次暴露激活的獎賞神經(jīng)元集群（嗎啡神經(jīng)元集群），隨后，借助病毒載體示蹤技術、光遺傳學技術、化學遺傳學技術、神經(jīng)遞質(zhì)探針、電生理記錄、熒光原位雜交、行為學實驗等多種技術手段，發(fā)現(xiàn)VTA嗎啡神經(jīng)元集群選擇性地投射到NAc，通過多巴胺依賴機制介導正性強化效應，抑制這類神經(jīng)元集群，會導致戒斷誘發(fā)的負性強化效應。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在嗎啡慢性給藥后，CeA腦區(qū)CRH神經(jīng)元與VTA嗎啡神經(jīng)元集群的抑制性突觸連接增強，從而介導了嗎啡戒斷誘發(fā)的厭惡和焦慮等負性情緒的產(chǎn)生。最后，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術下調(diào)嗎啡神經(jīng)元集群上的CRHR1受體的表達可減弱CRHCeA→VTA的抑制性輸入，緩解嗎啡戒斷誘發(fā)的負面情緒。該研究闡明了成癮性藥物嗎啡負性強化環(huán)路和分子機制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預靶點，具有重要科學和社會意義。
復旦大學腦科學研究院博士后江長優(yōu)為本文的第一作者，基礎醫(yī)學院博士研究生楊霄和何觀虹為本文的共同第一作者。腦科學研究院的馬蘭教授與王菲菲教授為本文的通訊作者。本文的合作者還有來自復旦大學附屬華山醫(yī)院的毛穎教授和徐文東教授。
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