暨南大學(xué)吳建國教授/潘攀研究團(tuán)隊(duì)，在Nature子刊《Nature Communication》發(fā)表題為“SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ），該研究展示了SARS-CoV-2 N蛋白通過促進(jìn)NLRP3炎癥小體激活誘導(dǎo)高炎癥反應(yīng)；N蛋白促進(jìn)促炎因子的成熟，并誘發(fā)細(xì)胞和小鼠的促炎反應(yīng)；N蛋白直接與NLRP3蛋白相互作用，促進(jìn)NLRP3與ASC結(jié)合，促進(jìn)NLRP3炎癥小體組裝；N蛋白加重膿毒癥和急性炎癥小鼠模型中肺損傷，加速死亡，促進(jìn)小鼠IL-1β和IL-6激活。
SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞和小鼠促炎反應(yīng)
首先，SARS-CoV-2感染巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DCs)后多種促炎因子趨化因子及配體均有不同程度增加；研究人員對SARS-CoV-2蛋白對IL-1β釋放的影響進(jìn)行研究，WB結(jié)果顯示N蛋白在HEK293T細(xì)胞表達(dá)最高(Fig.1c)，ELISA結(jié)果顯示N蛋白表達(dá)的HEK293T-NLRP3炎癥小體體系IL-1β最高(Fig.1d)，SARS-CoV-2 N蛋白加強(qiáng)Nigericin誘導(dǎo)的IL-1β分泌(Fig.1e)。因此SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟及分泌中發(fā)揮重要作用。N蛋白介導(dǎo)THP-1包含IL-1β在內(nèi)的炎癥因子表達(dá)， MCC950(NLRP3特異性抑制劑)可以抑制上述炎癥因子的表達(dá)(Fig.1g)。利用AAVlung-N在小鼠肺中表達(dá)N蛋白，AAVlung-N可以顯著增加IL-1β，IL-6，TNF，CXLC10，CCL2，IL-11，IL-7和CXCL8的mRNA表達(dá)，另外Ac-YVAD-cmk(Caspase-1抑制劑，阻斷IL-1β成熟)和MCC950對AAVlung-N誘導(dǎo)的上述因子表達(dá)均有不同程度的恢復(fù)作用(Fig.1h&1i)。因此，研究人員推測N蛋白促進(jìn)NLRP3炎性小體激活，從而誘導(dǎo)成熟IL-1β分泌，進(jìn)而在誘導(dǎo)炎癥因子和細(xì)胞因子中發(fā)揮關(guān)鍵作用。結(jié)果表明，SARS-CoV-2 N蛋白在誘導(dǎo)促炎因子中發(fā)揮關(guān)鍵作用，N蛋白可能參與調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的激活。
Fig. 1 SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)
SARS-CoV-2 N蛋白誘導(dǎo)IL-1β成熟和IL-6產(chǎn)生
考慮到激動劑對促炎因子表達(dá)的主導(dǎo)作用，接下來研究人員對SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟中的作用進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)N蛋白可以促進(jìn)IL-1β的分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1成熟且呈現(xiàn)劑量依賴，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可誘導(dǎo)IL-1β的分泌和cleavage，N蛋白可以進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β的分泌和cleavage(Fig.2a&2b)。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以促進(jìn)THP-1細(xì)胞IL-18和IL-6，N蛋白僅能促進(jìn)IL-6的分泌，不能促進(jìn)IL-18的分泌，MCC950抑制IL-1β和IL-6分泌；LPS+ATP或LPS+Nigericin同樣可以促進(jìn)BMDM細(xì)胞的IL-1β和IL-6的分泌，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin對IL-6和IL-1β分泌并無顯著促進(jìn)作用(Fig.2c-2j)。綜上所述，N蛋白誘導(dǎo)IL-1β的成熟和IL-6的產(chǎn)生，并揭示NLRP3是N誘導(dǎo)IL-1β分泌和IL-6產(chǎn)生所必需的，因此N蛋白可能在NLRP3炎癥小體的激活中發(fā)揮重要作用。
Fig.2 N蛋白誘導(dǎo)IL-1β成熟和IL-6生成
接下來研究者對SARS-CoV-2 N蛋白在NLRP3炎癥小體調(diào)控中的作用進(jìn)行研究。CO-IP結(jié)果顯示，N蛋白僅與NLRP3蛋白相互作用，且His-N蛋白可以直接與NLRP3蛋白結(jié)合(Fig.3a-3e)，N蛋白和NLRP3共定位于細(xì)胞質(zhì)中，N蛋白與ASC無交互作用(Fig.3f-3i)。所以，N蛋白特異性與NLRP3蛋白相互作用，調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體分泌。
Fig.3 SARS-CoV-2 N蛋白與NLRP3蛋白相互作用
通過評估N蛋白的截短突變體N1-N8，鑒定參與NLRP3相互作用的SARS-CoV-2 N蛋白序列。結(jié)果表明，NLRP3蛋白與N1、N5、N6和N7相互作用，并且IL-1β分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20 maturation 亦受N蛋白N1、N5、N6和N7影響(Fig.4a-4e)，因此，N蛋白260aa-340aa截短體參與了與NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎癥小體。
Fig.4 N蛋白截短體參與NLRP3炎癥小體激活
接下來研究人員對N蛋白在調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體成分中的作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，N蛋白對NLRP3、Caspase-1和ASC的蛋白水平?jīng)]有影響，然而NLRP3存在時N和ASC可以相互免疫沉淀(Fig.5a-5e)。因此，該結(jié)果提示N蛋白、NLRP3和ASC三個蛋白可能形成一個復(fù)雜的N-NLRP3-ASC復(fù)合物。N蛋白增強(qiáng)NLRP3與ASC的相互作用在HEK293T和A549細(xì)胞并呈劑量依賴(Fig.5f-5g)。同樣，在PMA-differentiated THP-1-N細(xì)胞中，Nigericin促進(jìn) N蛋白在NLRP3存在的情況下與內(nèi)源性ASC相互作用(Fig.5h)。因此，SARS-CoV-2 N 促進(jìn)NLRP3與ASC的相互作用。
Fig.5 N蛋白促進(jìn)NLRP3與ASC的相互作用
SARS-CoV-2 N蛋白促進(jìn)NLRP3炎性小體組成
對NLRP3在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行定位，NLRP3呈彌散狀分布于細(xì)胞質(zhì)，而SARS-CoV-2 N蛋白存在時，NLRP3呈聚集的斑點(diǎn)狀(Fig.6a)，SARS-CoV-2 3a蛋白與NLRP3共定位，但未能形成斑點(diǎn)狀聚集。SARS-CoV-2 N2和N8 截短體，同時分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中且不能與NLRP3和共定位，NLRP3在HEK293T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中未形成斑點(diǎn)狀聚集(Fig.6b&6c)。THP-1細(xì)胞中NLRP3分布與HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞幾乎一致，且N蛋白存在時，內(nèi)源性NLRP3蛋白在細(xì)胞質(zhì)中聚集形成斑點(diǎn)(Fig.6d&6e)。因此，SARS-CoV-2 N蛋白可能促進(jìn)NLRP3炎癥小體復(fù)合體的形成。
THP-1細(xì)胞和BMDM細(xì)胞中，Nigericin刺激內(nèi)源性ASC蛋白o(hù)ligomerization，并且N蛋白可以促進(jìn)這一反應(yīng)(Fig.6f&6g)。此外，HEK293T-NLRP3細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染編碼SARS-CoV-2-N蛋白及其截短突變體，ASC oligomerization被N1、N5、N6和N7蛋白激活，而不受N2、N3、N4、N8蛋白影響(Fig.6h)。所以，N蛋白序列260aa-340aa與NLRP3相互作用，促進(jìn)ASC oligomerization。
Fig.6 N蛋白促進(jìn)NLRP3聚集和ASC oligomerization
此外，研究人員還探究了N蛋白對NLRP3炎癥小體復(fù)合物組裝的影響。將HEK293T細(xì)胞或A549細(xì)胞共轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，GFP同時分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，NLRP3彌散狀分布于細(xì)胞質(zhì)(Fig.7a&7b(a-e));N蛋白和NLRP3表達(dá)時，NLRP3與N蛋白共定位，呈斑點(diǎn)狀(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表達(dá)時，GFP與ASC同時分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，并形成小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Fig.7a&7b(k-o))；N蛋白和ASC表達(dá)時，N蛋白和ASC無法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；GFP、ASC和NLRP3同時表達(dá)時，NLRP3和ASC共定位于細(xì)胞質(zhì)并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Fig.7a&7b(u-y))；值得注意的是，當(dāng)N蛋白、ASC和NLRP3同時表達(dá)時，3種蛋白共定位形成球狀結(jié)構(gòu)(Fig.7a&7b(z-d))；當(dāng)3a、ASC和NLRP3同時存在時，3種蛋白共定位未能形成球狀結(jié)構(gòu)(Fig.7a&7b(ae-ai))。綜上所述，SARS-CoV-2 N蛋白促進(jìn)NLRP3炎性小體復(fù)合物組裝，而非SARS-CoV-2 3a蛋白。
Fig.7 N蛋白促進(jìn)NLRP3炎性小體組裝
N蛋白激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)小鼠肺損傷
接下來，研究人員對SARS-CoV-2 N蛋白在激活NLRP3炎癥小體的生物學(xué)作用進(jìn)行評價。通過在C57BL/6小鼠表達(dá)N蛋白，探究N蛋白在肺損傷中的作用。注射AAVlung-N的小鼠，血清中IL-1β和IL-6的水平明顯高于對照組，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制該反應(yīng)(Fig.8a&8b)，但AAVlung表達(dá)N蛋白并未影響血清中IL-18的表達(dá)(Fig.8c)。AAVlung感染的小鼠肺部免疫熒光結(jié)果顯示，AAVlung-N小鼠肺部IL-1β和IL-6表達(dá)明顯高于其他分組，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可降低IL-1β和IL-6表達(dá)(Fig.8d&8e)。HE染色顯示，攜帶AAVlung-N的小鼠肺部有明顯的的炎癥病變及組織損傷，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑制肺組織的病變(Fig.8f)。這些結(jié)果表明NLRP3炎性小體是N蛋白誘導(dǎo)的小鼠肺損傷發(fā)生所必需的。
Fig.8 N蛋白激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)小鼠肺損傷
ELISA結(jié)果顯示，AAVlung-N誘導(dǎo)NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表達(dá)，在NLRP3-/-無明顯影響，說明NLRP3在N蛋白介導(dǎo)的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b)，對IL-18激活沒有影響（Fig.9c）。并且攜帶AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺組織免疫組化結(jié)果IL-1β和IL-6的表達(dá)明顯高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。HE病理染色同樣顯示攜帶AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有明顯的炎癥病變及組織損傷(Fig.9f)。因此，N蛋白通過激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)小鼠全身炎癥，引發(fā)肺損傷。
Fig.9 NLRP3在N蛋白誘導(dǎo)的肺損傷中發(fā)揮重要作用
綜上所述，研究人員揭示了COVID-19的病理機(jī)制，其中SARS-CoV-2 N蛋白通過促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活從而促進(jìn)炎癥和肺部損傷。
Fig.10 N蛋白通過激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)肺損傷模型
在該研究中，研究人員通過分析GEO數(shù)據(jù)庫(GSE155106)發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染巨噬細(xì)胞和DCs會促進(jìn)大量細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。通過篩。芯咳嗽狽⑾諷ARS-CoV-2 N蛋白通過激活NLRP3炎性小體，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)導(dǎo)致小鼠肺損傷，加重膿毒癥模型小鼠的死亡。N蛋白直接與NLRP3作用，促進(jìn)NLRP3炎性小體聚合，從而激活NLRP3炎性小體。綜上所述，該研究結(jié)果證實(shí)SARS-CoV-2 N蛋白通過NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)肺損傷的新機(jī)制。
● 九游會j9生物有幸為該研究提供AAVlung包裝服務(wù)。
