新品發(fā)布
隨著研究的不斷深入，現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)需要關(guān)注大量不同種類的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行精細(xì)研究，除了特異性啟動(dòng)子的應(yīng)用外，還可以借助多種Cre小鼠模型配合DIO病毒策略或flox小鼠策略以實(shí)現(xiàn)特異性操作神經(jīng)元的目的。
Cre-LoxP系統(tǒng)
來源于噬菌體P1的Cre/loxP系統(tǒng)主要包括2個(gè)重要組成部分：一個(gè)是loxP位點(diǎn)，另一個(gè)就是可以對loxP位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別的Cre酶，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組，實(shí)現(xiàn)對目的基因刪除、翻轉(zhuǎn)、易位和序列互換。在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，此技術(shù)可以用于對神經(jīng)環(huán)路的特異性標(biāo)記、特異細(xì)胞類型中內(nèi)源基因的功能研究及構(gòu)建小鼠模型等。(更多Cre體系相關(guān)內(nèi)容，可參考【知識(shí)分享】一半海水、一半火焰，分子表達(dá)操控中高頻出現(xiàn)的Cre、Flp、Dre等重組酶系統(tǒng)如何工作)
Cre鼠策略
利用基因敲入手段，借助CRISPR/Cas9技術(shù)，將Cre重組酶定點(diǎn)插入到小鼠基因組中，獲得可特異性在某類神經(jīng)元中表達(dá)Cre的工具鼠，從而可以配合AAV-DIO病毒載體，做到精準(zhǔn)操控神經(jīng)元的目的，亦可以和多種Flox鼠搭配使用，研究不同基因的功能。
以Thy1-iCre工具鼠為例構(gòu)建策略
錐體細(xì)胞是大腦皮層內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)元，所有的皮層信息傳出都是由錐體神經(jīng)元攜帶的，參與條件性恐懼反射（fear conditioning）、學(xué)習(xí)記憶（learning and memory）、感覺和運(yùn)動(dòng)（sensorimotor process）信息的處理等多種生理過程，在神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物造模及神經(jīng)損傷研究中均發(fā)揮重要作用。
Thy1是錐體神經(jīng)元的特異性啟動(dòng)子，在前腦、海馬、杏仁核、丘腦及視網(wǎng)膜等區(qū)域均有豐富的表達(dá)， Thy1-cre鼠配合重組AAV病毒可在以上腦區(qū)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性標(biāo)記、光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)操縱、在體鈣成像記錄，或者組織特異性的基因編輯。
Thy1-Cre鼠應(yīng)用策略
1、Thy1-Cre鼠配合AAV-DIO- DREADD病毒載體，操縱杏仁核BLA區(qū)Thy1陽性細(xì)胞改變恐懼記憶的消退和維持
在杏仁核中，Thy1陽性的細(xì)胞集中分布在基底外側(cè)部（basolateral），而Thy1陰性的細(xì)胞則廣泛分布于整個(gè)杏仁核。這兩類神經(jīng)元在恐懼記憶的形成、消退（extinction）和消退維持（retention）中分別起到了不同的作用。其中Thy1陽性標(biāo)記的細(xì)胞表現(xiàn)出對恐懼抑制或者被稱為“恐懼-關(guān)（Fear-Off）”神經(jīng)元的特性[1]。
在Thy1-Cre鼠BLA注射興奮性化學(xué)遺傳學(xué)病毒AAV-DIO-Gs-DREADD-IRES-mCherry，同時(shí)以AAV-CaMKII-eYFP作對照，可見Gs- DREADD的表達(dá)局限在BLA，但是對照病毒的熒光則廣泛地分布在整個(gè)杏仁核。在動(dòng)物進(jìn)行恐懼消退和消退維持實(shí)驗(yàn)前30 min于腹腔注射CNO。結(jié)果顯示，在恐懼消退過程中，使用化學(xué)遺傳手段增強(qiáng)BLA Thy1神經(jīng)元的興奮程度雖然使動(dòng)物的恐懼行為出現(xiàn)下降，但相比對照動(dòng)物這一變化在統(tǒng)計(jì)上并未表現(xiàn)出顯著。然而在恐懼消退維持測試中增強(qiáng)BLA Thy1神經(jīng)元的興奮程度可以使動(dòng)物的恐懼行為顯著下降，這提示增加BLA Thy1陽性神經(jīng)元的活動(dòng)有助于恐懼記憶消退的鞏固。
AAV-DIO-Gs-DREADD注射于Thy1-Cre鼠
2、基于Thy1-Cre工具鼠追蹤直接投射到腹側(cè)和背側(cè)海馬CA1區(qū)的圖譜
在Thy1-cre工具鼠的腹側(cè)海馬（vCA1）和背側(cè)海馬（dCA1）先后注射表達(dá)綠色熒光的Helper病毒和表達(dá)紅色熒光的RV病毒，同時(shí)感染2種病毒的起始神經(jīng)元（starter cell）共標(biāo)記為黃色[2]。
Thy1-Cre配合AAV helper和RV病毒實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元跨單突觸標(biāo)記
3、條件性敲除BIN1改變神經(jīng)元活動(dòng)性
使用Thy1-Cre鼠和Bin1flox/flox鼠雜交，從而在興奮性神經(jīng)元中特異性地敲除Bin1基因。使用c-Fos染色標(biāo)記活動(dòng)的神經(jīng)元數(shù)量。結(jié)果表明，在引入外界刺激的情況下，在海馬及壓后皮層中對照組小鼠的c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著高于Bin1敲除組。但是在將動(dòng)物暴露在新環(huán)境后，Bin1敲除鼠齒狀回的c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)量高于對照鼠。以上結(jié)果表明，在興奮性神經(jīng)元中敲除Bin1可以改變神經(jīng)元的活動(dòng)[3]。
Thy1-Cre鼠和flox鼠雜交實(shí)驗(yàn)條件性敲除目的
錐體神經(jīng)元參與多種生理過程，而Thy1-Cre工具鼠的出現(xiàn)可實(shí)現(xiàn)特異性針對錐體神經(jīng)元操控，是一項(xiàng)重要的實(shí)用技術(shù)手段，目前，九游會(huì)j9生物已制備成熟的Thy1-Cre小鼠，同時(shí)，為配合Cre鼠的多種應(yīng)用策略，九游會(huì)j9現(xiàn)推出Cre鼠+AAV病毒打包促銷活動(dòng)：
病毒載體介導(dǎo)的Cre/loxP系統(tǒng)
相較于轉(zhuǎn)基因小鼠，借助病毒載體介導(dǎo)的Cre系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特異性操作神經(jīng)元或基因的目的，同時(shí)可以大大縮短實(shí)驗(yàn)的周期，另外，多種多樣的病毒載體，可以最大限度的滿足各類實(shí)驗(yàn)的需求。各類病毒載體的特點(diǎn)如下：
Cre-loxp系統(tǒng)的應(yīng)用
特異性標(biāo)記/環(huán)路示蹤
可以借助Cre品系的小鼠和Cre依賴表達(dá)的病毒載體結(jié)合使用，達(dá)到特異性對某些細(xì)胞的標(biāo)記和操控目的。運(yùn)用神經(jīng)示蹤技術(shù)對大腦特定神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行解析時(shí)，亦可以借助Cre重組酶系統(tǒng)和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1）結(jié)合適用，達(dá)到特異性對神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記和功能研究的目的。
基于rAAV1-Cre順行單級跨突觸示蹤
（Zheng P’s lab., Sci Adv., 2019[4]）
在實(shí)際進(jìn)行實(shí)驗(yàn)課題過程中，病毒載體輔助和Cre小鼠的配合使用即有互補(bǔ)性，又能相互驗(yàn)證，成為動(dòng)物體內(nèi)研究尤其是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究中不可或缺的助力。
參考文獻(xiàn)
[1] Nat Commun. 2016 Oct 21;7:13149.doi: 10.1038/ncomms13149.
[2] Front Neural Circuits. 2021 Apr 14;15:643230.doi: 10.3389/fncir.2021.643230.
[3] PLoS One. 2019 Aug 13;14(8):e0220125.doi: 10.1371/journal.pone.0220125
[4] Sci Adv. 2019 Feb 20;5(2):eaat3210. doi: 10.1126/sciadv.aat3210.
