Cre（Cyclization Recombination Enzyme）是一種重組酶，來源于P1噬菌體，其基因編碼區(qū)序列全長1029bp，為38kDa大小的、由343個(gè)氨基酸組成的多肽單體蛋白。Cre重組酶的C-末端結(jié)構(gòu)域包含催化活性位點(diǎn)，能夠催化DNA分子中特定位點(diǎn)之間的重組，同時(shí)，Cre還能識(shí)別特異的DNA序列，即loxP位點(diǎn)，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)間發(fā)生基因重組。

LoxP是Locus of X-overP1的縮寫，是位于P1噬菌體中長度為34bp的一段序列，由兩個(gè)13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，反向回文序列是Cre重組酶的識(shí)別和結(jié)合區(qū)域，間隔序列決定LoxP序列的方向。
 

Cre/loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

一般而言，當(dāng)細(xì)胞基因組內(nèi)存在兩個(gè)LoxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶會(huì)誘導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列發(fā)生重組。重組的結(jié)果取決于兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向，主要有以下幾種可能：

① 如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶能有效地刪除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列（Deletion）（圖1A）；
② 如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上但方向相反，Cre重組酶能誘導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列翻轉(zhuǎn)（Inversion）（圖1B）；
③如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)兩條DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位，即基因轉(zhuǎn)座（Translocation）（圖1C）
④如果四個(gè)loxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導(dǎo)loxP間的序列互換（cassette exchange）（圖1D）。

圖1 Cre-loxP誘導(dǎo)基因重組的方式

Cre-LoxP系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的操控，根據(jù)Cre重組系統(tǒng)誘導(dǎo)基因重組的方式，九游會(huì)j9可以通過如下三種策略實(shí)現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)：

1、LSL序列（條件性基因選擇）

此情況下，在無Cre酶存在的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒下游靶基因完全不表達(dá)，但如果細(xì)胞中含有Cre酶，基因重組中的Deletion過程發(fā)生，移除轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)盒，進(jìn)而表達(dá)目的基因。這是一種簡單有效的辦法，九游會(huì)j9可以通過LSL的設(shè)置，有選擇性地在某些細(xì)胞中表達(dá)基因。
 

圖2 Cre依賴的基因表達(dá)-LSL策略

2、DIO/DO序列

這種策略被稱為DIO（Cre-on）或DO（Cre-off）。在這種策略下，任一對(duì)Lox位點(diǎn)間的序列會(huì)在Cre的作用下發(fā)生可逆的快速翻轉(zhuǎn)，之后Cre重組酶馬上不可逆地切割翻轉(zhuǎn)后的同向Lox位點(diǎn)，只留下翻轉(zhuǎn)后的基因和單獨(dú)的LoxP、Lox2272位點(diǎn)，防止基因的再次翻轉(zhuǎn)。這種巧妙的設(shè)計(jì)讓科研人員可以在病毒載體中構(gòu)建DIO和反向基因，感染Cre陽性細(xì)胞后，可以讓Cre陽性的細(xì)胞表達(dá)基因，是為DIO結(jié)構(gòu)；如果預(yù)先包裝的基因是正向，那么Cre陽性的細(xì)胞則不表達(dá)基因，其余細(xì)胞表達(dá)基因，是為DO結(jié)構(gòu)。因此，人為操控基因表達(dá)變成了現(xiàn)實(shí)。

 

圖3借助LoxP和Lox2272的FLEX策略實(shí)現(xiàn)Cre依賴的基因表達(dá)
（Scott M. Sternson, et al., J. Neurosci., 2008）

3、MADM系統(tǒng)

雙標(biāo)記嵌合體分析MADM（mosaic analysis with the double markers）系統(tǒng)，是基于Cre誘導(dǎo)發(fā)生Translocation過程實(shí)現(xiàn)的。通過同源重組將兩個(gè)相互嵌合的標(biāo)記基因（熒光蛋白）分別定位到同源染色體上的相同位點(diǎn)，位于同一條DNA鏈上的熒光蛋白N端（C端）和另一種熒光蛋白N端（C端）之間插入一個(gè)Loxp位點(diǎn)。在沒有Cre的情況下，不表達(dá)功能性的GFP或RFP；但在特定時(shí)期、特定細(xì)胞中表達(dá)Cre時(shí)，Cre能誘導(dǎo)帶有兩種不同熒光蛋白N端的DNA鏈與另一條帶有相同熒光蛋白C端的DNA鏈在細(xì)胞有絲分裂G2期發(fā)生重組，使得兩個(gè)子代細(xì)胞分別表達(dá)有任一種有功能性的熒光蛋白（稱為：X-segregation），或者其中一個(gè)子代細(xì)胞表達(dá)兩種熒光蛋白而另一種子代細(xì)胞不帶任何功能性熒光蛋白（稱為：Z-segregation）。另外，重組也可能發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期或者G0期，在這種情況下，細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種熒光蛋白。

圖4 MADM系統(tǒng)
（Zong Hui, et al., Cell., 2005）

 

Cre/loxp系統(tǒng)的應(yīng)用

通過病毒引入Cre或loxP元件，結(jié)合一種轉(zhuǎn)基因小鼠可達(dá)到對(duì)某類細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記或基因操作的目的。

LSL策略應(yīng)用

mT/mG（ROSA-pCA-loxp-mT-pA-loxp-mG-pA）鼠是一種雙熒光報(bào)告鼠，這種鼠在正常情況下表達(dá)定位在膜上的紅色熒光蛋白（TdTomato），而當(dāng)細(xì)胞表達(dá)Cre后，則表達(dá)定位在膜上的綠色熒光蛋白（GFP）。

Alb為成年動(dòng)物肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，將rAAV2/8-Alb-Cre病毒尾靜脈注射mT/mG小鼠，可發(fā)現(xiàn)特異性感染小鼠肝臟組織（綠色），而心臟組織未被感染（表現(xiàn)為紅色）。
 

圖5肝臟組織（左）、心臟組織（右）

 

病毒產(chǎn)品	rAAV2/8-Alb-Cre
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	mT/mG鼠
注射方式	尾靜脈注射
感染部位	肝臟組織
病毒用量	2E+11VG/只

 

管吉松教授團(tuán)隊(duì)將AAV-hSyn-Cre注射于Ash1l^fl/fl小鼠右側(cè)AUD區(qū)條件性敲除Ash1l基因，發(fā)現(xiàn)Ash1l以細(xì)胞自主效應(yīng)的方式介導(dǎo)皮層神經(jīng)元的活動(dòng)依賴的突觸修剪過程。（點(diǎn)擊閱讀：Neuron | 拯救星星之子！上科大管吉松組揭示ASH1L單倍不足致小鼠自閉癥的神經(jīng)機(jī)制）

 

圖6 AAV-Cre注射Flox小鼠實(shí)現(xiàn)條件性敲除
 （Yan Yuze, et al., Neuron., 2022）

 

病毒產(chǎn)品	pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE pAAV-hSyn-Cre-WPRE
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物	Ash1lfl/fl小鼠
注射方式	腦定位注射
感染部位	小鼠右側(cè)腦AUD區(qū)
注射體積	300nL

 

 

 

Thy1是錐體神經(jīng)元的特異性啟動(dòng)子，在前腦、海馬、杏仁核、丘腦及視網(wǎng)膜等區(qū)域均有豐富的表達(dá)， Thy1-cre鼠配合rAAV載體可在以上腦區(qū)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性標(biāo)記、光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)操縱、在體鈣成像記錄，或者組織特異性的基因編輯。

運(yùn)用神經(jīng)示蹤技術(shù)對(duì)大腦特定神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行解析時(shí)，亦可以借助Cre重組酶系統(tǒng)和AAV血清型（比如rAAV2/9、rAAV2/retro、rAAV2/1）結(jié)合適用，達(dá)到特異性對(duì)神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記和功能研究的目的。