時(shí)間：2023-05-31 熱度：

氟化物是一種公認(rèn)的環(huán)境污染物，在全球范圍內(nèi)廣泛存在，我國(guó)長(zhǎng)期存在飲水型、燃煤型及飲茶型等不同類型的高氟暴露現(xiàn)象，是遭受氟威脅最嚴(yán)重、地區(qū)分布最廣泛的國(guó)家之一。雖然適量的氟對(duì)機(jī)體牙齒、骨骼的鈣化、神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)和酶系統(tǒng)的代謝均有促進(jìn)作用，但大量的研究表明高氟暴露可嚴(yán)重：褰】，包括誘發(fā)氟中毒，氟骨病等，還會(huì)對(duì)腎臟、肝臟、心血管、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織均有不同程度的損害作用。值得注意的是，氟化物引起的腦損傷導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的報(bào)道先于牙齒病變，研究發(fā)現(xiàn)，氟化物暴露可損害神經(jīng)中樞并誘導(dǎo)記憶功能障礙，且腦功能損傷及其潛在機(jī)制可能因氟化物劑量而異。然而氟化物誘發(fā)腦功能障礙的機(jī)制仍不明確。

研究成果

2023年5月7日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院倪學(xué)勤教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際環(huán)境領(lǐng)域知名期刊《Journal of Hazardous Materials》上發(fā)表題為“Prolonged Fluoride Exposure Induces Spatial-memory Deficit and Hippocampal Dysfunction by Inhibiting Small Heat Shock Protein 22 in Mice”的研究論文。該研究揭示了長(zhǎng)期高氟飲水可導(dǎo)致小鼠線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能的蛋白Hsp22通過(guò)介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路參與高氟所致空間記憶損傷的重要潛在機(jī)制。該成果進(jìn)一步提示了長(zhǎng)期生活于高氟暴露地區(qū)人民的潛在健康隱患。

 

結(jié)果

01  長(zhǎng)期接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶缺陷及認(rèn)知功能障礙

首先，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建氟暴露小鼠模型：4周齡小鼠給予含25ppm（低劑量組）或50ppm（高劑量組）NaF的含氟飲用水，持續(xù)56周至老年期（圖1A）。借助Morris水迷宮試驗(yàn)（Morris water maze, MWM）探討了慢性氟化物暴露對(duì)認(rèn)知功能的影響，定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟暴露組小鼠的逃避潛伏期顯著增加，在有效區(qū)域（原平臺(tái)所在區(qū)域）穿梭停留時(shí)間明顯降低，提示了長(zhǎng)期接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶缺陷，認(rèn)知學(xué)習(xí)能力下降，且損傷程度與氟暴露之間存在劑量依賴關(guān)系（圖1）。

 

圖1 長(zhǎng)時(shí)間接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶障礙

 

為研究氟暴露是否會(huì)在短期內(nèi)導(dǎo)致小鼠記憶缺陷，研究者分別給予8周齡和48周齡小鼠含氟（50ppm）飲用水，連續(xù)12周（圖2A,B）。MWM結(jié)果顯示，短期氟暴露組小鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)及逃避潛伏期和對(duì)照組小鼠相比無(wú)明顯區(qū)別（圖2C,D），神經(jīng)元功能維持至關(guān)重要的功能基因BDNF和CREB蛋白表達(dá)水平也無(wú)明顯變化（圖2E,F）。這些結(jié)果提示了氟化物暴露在短期內(nèi)不會(huì)引起記憶缺陷，引起高氟所致空間記憶損傷取決于長(zhǎng)期暴露。

 

圖2 短期氟化物暴露不會(huì)引起小鼠記憶缺陷

 

02 長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)小鼠海馬損傷及線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)探究長(zhǎng)時(shí)間氟暴露對(duì)小鼠海馬的影響，發(fā)現(xiàn)氟暴露組小鼠的體重、腦重，以及高劑量氟暴露組（F-High）小鼠的腦體指數(shù)均明顯低于對(duì)照組小鼠（圖3A），氟暴露引起的病理改變主要在海馬CA3和CA1區(qū)，表現(xiàn)為神經(jīng)元變性顯著增加，F(xiàn)-High組小鼠神經(jīng)元數(shù)量明顯降低（圖3D）。氟暴露組小鼠海馬中BDNF和CREB的mRNA和蛋白水平顯著下降（圖3B,C,E）。這些結(jié)果提示了長(zhǎng)期接觸氟化物誘導(dǎo)海馬損傷。

 

圖3 長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)海馬損傷和記憶相關(guān)蛋白下調(diào)

 

隨后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了氟暴露對(duì)海馬神經(jīng)振蕩和神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放的影響。通過(guò)對(duì)小鼠海馬CA1神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞外記錄，發(fā)現(xiàn)氟暴露誘發(fā)局部場(chǎng)電位（local field potential, LFP）光譜功率變化，LFP顯著降低，同時(shí)theta, alpha, beta和gamma頻段振蕩下降（圖4B）。此外，氟暴露組小鼠的海馬神經(jīng)元放電明顯降低，誘導(dǎo)LTP的能力受損（圖4C,D）。以上結(jié)果均呈劑量依賴性（圖4）。

 

圖4 長(zhǎng)期氟暴露改變了海馬神經(jīng)元放電

 

透射電鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，氟暴露組小鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)元凋亡（圖5A），線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）和ATP含量呈劑量依賴性下降（圖5B,C）。通過(guò)對(duì)海馬線粒體呼吸鏈復(fù)合體分析發(fā)現(xiàn)，氟暴露導(dǎo)致線粒體生物發(fā)生受到抑制，呼吸鏈復(fù)合體I/II/III/V活性明顯降低（圖5D-G）。

 

圖5 長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元線粒體功能障礙

 

03  長(zhǎng)期氟暴露抑制Hsp22的表達(dá)及其介導(dǎo)的PGC-1α/ TFAM和NF-κβ/STAT3信號(hào)通路

基于上述結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探討了介導(dǎo)這些影響的潛在調(diào)節(jié)因子。借助分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間氟暴露組小鼠中Hsp22和ATF4的表達(dá)顯著降低（圖6A,B）。Hsp22缺失和ATF4高表達(dá)抑制了線粒體功能，Hsp22可通過(guò)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路介導(dǎo)線粒體功能。PGC-1α-TFAM信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物發(fā)生，NF-κβ-STAT3信號(hào)通路提高線粒體呼吸鏈酶的活性。鑒于此，作者研究這兩條信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，氟暴露導(dǎo)致PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號(hào)通路被抑制，PGC-1α蛋白水平降低，高劑量氟暴露組TFAM蛋白水平亦顯著降低（圖6C-E）。此外，細(xì)胞和線粒體中STAT3的蛋白水平各組間無(wú)顯著差異，線粒體中p-S727 STAT3（被Hsp22激活并易位到線粒體的效應(yīng)蛋白）表達(dá)水平呈氟暴露劑量依賴性降低（圖6E,F）。

 

圖6 長(zhǎng)期氟暴露抑制海馬Hsp22的表達(dá)及其介導(dǎo)的線粒體調(diào)控通路

04  Hsp22通過(guò)介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號(hào)通路雙向調(diào)控長(zhǎng)期氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷

為探究Hsp22是否參與氟暴露誘導(dǎo)的小鼠記憶缺陷，研究者在小鼠海馬區(qū)注射pAAV-hSyn-EGFP-P2A-Hspb8–3xFLAG-WPRE病毒，以特異性在海馬神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)Hsp22（圖7A-C）。MWM結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Hsp22（F + pAAV-Hsp22）可顯著逆轉(zhuǎn)由氟化物暴露引起的逃避潛伏期增加和穿越原平臺(tái)次數(shù)減少的現(xiàn)象（圖7D,E）。這提示了Hsp22過(guò)表達(dá)改善了長(zhǎng)時(shí)間氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷。

 

圖7 海馬神經(jīng)元過(guò)表達(dá)Hsp22可改善長(zhǎng)期氟暴露引起的記憶缺陷

 

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Hsp22過(guò)表達(dá)改善氟暴露引起的突觸可塑性損傷（圖8A-C），以及逆轉(zhuǎn)了線粒體生物發(fā)生受到抑制的情況，恢復(fù)線粒體呼吸鏈復(fù)合體I/II/V活性，促進(jìn)ATP水平升高，改善線粒體功能障礙（圖8D-E）。

 

圖8 海馬神經(jīng)元過(guò)表達(dá)Hsp22通過(guò)介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和STAT3信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

 

最后，研究者在小鼠海馬區(qū)下調(diào)Hsp22的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證其在氟化物誘導(dǎo)記憶缺陷中的作用，將pAAV-U6-shRNA(Hspb8)-CMV-EGFP-WPRE注射小鼠海馬以下調(diào)Hsp22的表達(dá)（圖9A-C）。MWM結(jié)果顯示，氟暴露組小鼠海馬下調(diào)Hsp22表達(dá)（F+Hsp22 shRNA）后，加重了小鼠空間記憶損傷，表現(xiàn)為更明顯延長(zhǎng)的逃避潛伏期（圖9D-E）。

 

圖9 Hsp22缺失加重了長(zhǎng)期氟暴露誘發(fā)的記憶缺陷

 

借助分子生物學(xué)技術(shù)和電生理記錄顯示，Hsp22缺失對(duì)正常小鼠線粒體功能沒(méi)有影響，但加重了氟暴露誘發(fā)的海馬突觸可塑性損傷及線粒體生物發(fā)生（圖10）。

 

綜上，這些數(shù)據(jù)提示了海馬神經(jīng)元中Hsp22參與氟暴露誘導(dǎo)的小鼠記憶缺陷機(jī)制，其通過(guò)介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號(hào)通路雙向調(diào)控長(zhǎng)期氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷，海馬神經(jīng)元中高表達(dá)Hsp22可通過(guò)激活信號(hào)通路促進(jìn)線粒體生物發(fā)生和線粒體呼吸復(fù)合物活性的增強(qiáng)改善氟化物所致的空間記憶缺陷；而下調(diào)Hsp22的表達(dá)通過(guò)抑制線粒體功能加劇高氟導(dǎo)致的認(rèn)知能力下降。

 

圖10 Hsp22缺失加劇了長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

 

結(jié)論

本文借助分子生物學(xué)技術(shù)、行為學(xué)范式、病毒載體介導(dǎo)的基因功能獲得/丟失、電生理記錄等手段揭示了長(zhǎng)期氟暴露對(duì)小鼠空間記憶的影響及其機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期低劑量高氟飲水可致小鼠空間記憶障礙，海馬線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，且調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能的蛋白Hsp22表達(dá)受到抑制。通過(guò)AAV介導(dǎo)的活體特異性調(diào)控海馬Hsp22表達(dá)，證實(shí)Hsp22下調(diào)介導(dǎo)的PGC-1α/ TFAM-mtDNA信號(hào)軸以及NF-κβ/STAT3-線粒體酶活性信號(hào)軸的抑制是氟所致空間記憶損傷的重要潛在機(jī)制。該成果為長(zhǎng)期氟暴露導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了理論支持，并進(jìn)一步揭示了長(zhǎng)期生活于高氟暴露地區(qū)人民的潛在健康隱患。

 

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院博士辛金鴿為論文第一作者，倪學(xué)勤教授為通訊作者。電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院徐鵬教授為論文共同通訊作者。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金及四川省自然科學(xué)基金的支持。

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原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389423008786