聽力喪失是最常見的感官障礙之一，影響著很多人。根據(jù)世衛(wèi)組織公布的《世界聽力報告》，現(xiàn)有超15億人患有不同程度的聽力損失，到2050年，患聽力損失的人數(shù)將近25億。據(jù)統(tǒng)計，大約50%的先天性聽力損失與遺傳因素有關(guān)，目前臨床上的治療方案主要為佩戴助聽器或植入人工耳蝸，但此類方法沒有基于病因?qū)W從根本上治愈聽力損傷。因此，治療聽力損失需要更好的替代療法。隨著基因治療的蓬勃發(fā)展，基于病毒載體的基因療法成為治療遺傳性聽力損失的新熱門賽道。

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來主任長期致力于研究耳聾基因治療及臨床轉(zhuǎn)化，在顯性和隱性遺傳性耳聾、后天性耳聾的防治上取得了諸多進(jìn)展，為耳聾的治療開辟了新方向。

2021年6月，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來主任、李華偉教授與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院（深圳）農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉研究員等團(tuán)隊合作在Molecular Therapy上發(fā)表題為Gene editing in a Myo6 semi-dominant mouse model rescues auditory function的研究論文[1]。該研究以模擬顯性感音神經(jīng)性耳聾小鼠模型（Myo6^WT/C442Y鼠）為對象，借助AAV-PHP.eB基因治療遞送載體，搭載CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)（AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-Myo6-g2），高效轉(zhuǎn)染內(nèi)耳毛細(xì)胞，實現(xiàn)了在體特異性敲除Myo6^C442Y等位基因，并在長達(dá)5個月的時間內(nèi)觀察到了聽覺功能的恢復(fù)。這也是國際上第一個利用CRISPR/Cas9技術(shù)針對Myo6基因突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾進(jìn)行治療，并獲得成功的研究。為遺傳性耳聾基因治療臨床轉(zhuǎn)化提供了堅實的科學(xué)依據(jù)。
 

AAV-PHP.eB攜帶CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)基因編輯（PMID: 34174443）

在遺傳性耳聾中，隱性遺傳占大多數(shù)。2022年2月，三位科學(xué)家又合作在Cell Research在線發(fā)表題為“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究論文[2]。該研究以AAV-PHP.eB和AAV9雙載體作為高效的基因治療遞送載體，轉(zhuǎn)染Klhl18^lowf鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞，成功糾正了Klhl18基因C>A點突變，持久改善了聽覺功能。首次實現(xiàn)基于CRISPR/Cas9-HMEJ技術(shù)治療隱性遺傳性感音神經(jīng)性聾成功的研究，為遺傳性耳聾的精準(zhǔn)治療以及臨床轉(zhuǎn)化提供了強(qiáng)有力的科學(xué)證據(jù)。（閱讀原文：Cell Res | 舒易來/李華偉/左二偉團(tuán)隊開發(fā)CRISPR/Cas9-HMEJ系統(tǒng)取得遺傳性聾基因治療新突破）

設(shè)計HMEJ同源重組治療方案。a 針對篩選的sgRNA，設(shè)計HMEJ同源臂。b 基于AAV作為體內(nèi)遞送載體的雙AAV治療體系，其中一個AAV遞送用于表達(dá)Cas9的載體，另外一個遞送表達(dá)sgRNA以及攜帶同源臂的載體。（PMID: 35197607）

基于RNA靶向CRISPR/CasRx系統(tǒng)具有特異性識別和編輯RNA的能力。同年3月，復(fù)旦大學(xué)舒易來主任、李耕林研究員與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)胡曉湘教授合作發(fā)現(xiàn)基于CRISPR/CasRx編輯系統(tǒng)在治療常染色體顯性遺傳性聽力損失中的作用。研究以高效的基因治療遞送載體--AAV-PHP.eB遞送特異性靶向和編輯RNA的CRISPR/CasRx系統(tǒng)至Bth鼠內(nèi)耳中，Bth鼠為Tmc1基因突變的顯性耳聾小鼠模型，借助CRISPR/CasRx系統(tǒng)敲低Tmc1^Bth等位基因的轉(zhuǎn)錄本，有效改善了毛細(xì)胞和靜纖毛束的形態(tài)，防止了進(jìn)行性聽力損失。該研究成果發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊，標(biāo)題為：Preventing autosomal-dominant hearing loss in Bth mice with CRISPR/CasRx-based RNA editing[3]。
 

AAV- CRISPR/CasRx系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)基因編輯方案（PMID: 35283480）

感音性耳聾有先天與后天之分，后天性耳聾是耳聾患者的重要部分，致聾原因主要包括耳毒性藥物、噪音、老化、感染等因素，目前尚無可治療的藥物（突發(fā)性耳聾除外）。2022年4月，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來主任、李華偉教授與陳兵教授團(tuán)隊借助CRISPR-CasRx的RNA編輯技術(shù)成功防治了耳毒性藥物引起的后天性感音神經(jīng)性耳聾。研究成果發(fā)表在Molecular Therapy-Nucleic Acids 雜志上，題為：Specific knockdown of Htra2 by CRISPR-CasRx prevents acquired sensorineural hearing loss in mice[4]。該研究基于前期研究成果，通過AAV- PHP.eB-RfCas13d-sgRNA3高效轉(zhuǎn)染幼鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞，借助RfCas13d特異性靶向并高效切割RNA的特性，下調(diào)幼鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中Htra2基因表達(dá)，顯著提升了氨基糖甙類抗生素（aminoglycosides，AGs）暴露后小鼠耳蝸毛細(xì)胞的存活，并明顯改善了后天性感音神經(jīng)性耳聾小鼠的聽覺功能。該研究創(chuàng)新性地以CRISPR-CasRx 基因編輯技術(shù)在小鼠模型中實現(xiàn)了高效敲降靶點RNA的目的，證明了CRISPR-CasRx系統(tǒng)在臨床上防治后天性耳聾具有巨大的應(yīng)用潛力。
 

AAV-CRISPR-CasRx編輯系統(tǒng)改善了后天性感音神經(jīng)性耳聾小鼠的聽覺功能（PMID: 35615000）

2022年6月，舒易來團(tuán)隊創(chuàng)新性構(gòu)建Atoh1-GFP小鼠以準(zhǔn)確檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)在內(nèi)耳毛細(xì)胞中的編輯效率。并借助AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-g3高效轉(zhuǎn)染Kcnq^4+/G229D幼鼠內(nèi)耳，顯著改善小鼠的聽覺功能。該研究為精準(zhǔn)評估CRISPR/Cas9在體內(nèi)的編輯效率提供了方向，促進(jìn)了CRISPR基因編輯系統(tǒng)在疾病治療中的應(yīng)用。該研究發(fā)表在Molecular Therapy-Nucleic Acids 雜志上，題為：Precise detection of CRISPR-Cas9 editing in hair cells in the treatment of autosomal dominant hearing loss[5]。

檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)在內(nèi)耳毛細(xì)胞中的編輯效率及AAV-PHP.eB-SaCas9-KKH-g3基因編輯（PMID: 36035752）

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相關(guān)論文鏈接：

[1] https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.06.015

[2] https://doi.org/10.1038/s41422-022-00624-y

[3] https://doi.org/10.1038/s41392-022-00893-4

[4] https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.04.014

[5] https://doi.org/10.1016/j.omtn.2022.07.016

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