?前言

2022年8月，阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校Lewis Shi團(tuán)隊在Nature Communications發(fā)表“Selective suppression of melanoma lacking IFN-γ pathway by JAK inhibition depends on T cells and host TNF signaling”，該研究利用IFNγR1敲除的黑色素瘤細(xì)胞，構(gòu)建免疫檢查點阻斷劑（immune checkpoint blocker, ICB）耐藥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)ICB耐藥的潛在靶點JAK1/2，其抑制劑以T細(xì)胞和腫瘤壞死因子依賴的方式選擇性抑制IFN-γ信號缺失的黑色素瘤。

背景介紹

ICB是惡性腫瘤治療領(lǐng)域的重大突破，尤其是在黑色素瘤中。腫瘤細(xì)胞會通過控制免疫檢查點蛋白，如CTLA-4、PD-1、PD-L1等，來逃避免疫監(jiān)視。ICB則通過阻斷免疫檢查點，在腫瘤浸潤T細(xì)胞（tumor-infiltrating T cell, TIL）中增強免疫效應(yīng)功能，并且降低免疫抑制的FoxP3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T_reg）的豐度，從而實現(xiàn)對腫瘤的抑制。

盡管如此，仍有許多患者對ICB治療耐受，其中一個主要原因是腫瘤細(xì)胞IFN-γ信號缺失，目前尚缺乏針對ICB耐藥的治療策略。腫瘤內(nèi)IFN-γ信號在ICB抗腫瘤功能中是必需的，但在作者的前期研究中，對黑色素瘤敲低IFNγR1（IFNγR1^KD）卻并沒有明顯改變TIL中CD8⁺/T_reg比例，這可能由于細(xì)胞中仍有殘余的IFN-γ信號。作者考慮利用CRISPR技術(shù)對IFNγR1進(jìn)行敲除，進(jìn)而探究克服ICB耐藥的潛在靶點。

研究思路

01 構(gòu)建IFNγR1敲除的黑色素瘤細(xì)胞系，以及移植瘤小鼠模型，驗證模型能夠有效模擬IFN-γ信號缺失導(dǎo)致的ICB耐藥。

02 從腫瘤免疫微環(huán)境分析ICB耐藥，檢測IFN-γ信號缺失對TIL的影響，發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號缺失使腫瘤內(nèi)T細(xì)胞特征減少。

03 利用激酶組分析尋找可能的ICB耐藥靶點，發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號缺失的黑色素瘤細(xì)胞中JAK1/2激酶通路的激活。

04 分別從胞外和胞內(nèi)探究JAK1/2通路激活的因素，找到PI3K-Akt和mTOR信號通路，通過不同抑制劑處理等證明mTOR在上游調(diào)控JAK1/2通路。

05 體內(nèi)驗證JAK1/2抑制劑可以通過T細(xì)胞和TNF因子依賴的方式特異性阻礙IFN-γ信號缺失的黑色素瘤生長。

研究內(nèi)容

首先，作者利用CRISPR-Cas9技術(shù)在B16細(xì)胞中敲除IFNγR1（IFNγR1^KO），并接種至BL6小鼠中構(gòu)建黑色素瘤小鼠模型。經(jīng)驗證IFNγR1^KO細(xì)胞對IFN-γ的刺激沒有響應(yīng)，表現(xiàn)為JAK2磷酸化、Irf1、PD-L1、MHC-I/II等在IFN-γ刺激下均沒有上調(diào)，此外IFN-γ也不能誘導(dǎo)IFNγR1^KO細(xì)胞凋亡或抑制其細(xì)胞增殖。IFNγR1的敲除本身對B16細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力沒有影響，但I(xiàn)FNγR1^KO黑色素瘤對CTLA-4抗體的處理耐受。與體外數(shù)據(jù)一致，體內(nèi)IFNγR1^KO黑色素瘤經(jīng)CTLA-4抗體治療后，PD-L1和MHC-II等表達(dá)也沒有上調(diào)。

接下來作者分析IFNγR1^KO黑色素瘤中的TIL表型。流式發(fā)現(xiàn)CD8⁺ T細(xì)胞的基數(shù)減少，并且CTLA-4抗體治療不會像對照黑色素瘤那樣，增加T細(xì)胞浸潤、減少瘤內(nèi)T_reg細(xì)胞比例、或促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞因子分泌等等。對TCGA數(shù)據(jù)庫中黑色素瘤進(jìn)行分析，按照IFNGR1表達(dá)量分為兩組，發(fā)現(xiàn)IFNGR1低表達(dá)的黑色素瘤中T細(xì)胞特征基因表達(dá)降低，包括T細(xì)胞表面標(biāo)志物、效應(yīng)分子和MHC分子等，同時IFNGR1低表達(dá)的黑色素瘤患者生存率也顯著降低。相比于皮膚黑色素瘤（SKCM），葡萄膜黑色素瘤（UVM）對免疫檢驗點抑制劑（ICB）更加耐受，數(shù)據(jù)庫表明UVM中IFNGR1表達(dá)，以及T細(xì)胞特征基因表達(dá)更低。

考慮到酪氨酸激酶在IFN-γ信號中的重要作用，作者對IFNγR1^KO細(xì)胞進(jìn)行了激酶組活性分析，試圖在其中尋找克服ICB耐藥的靶點。這一分析發(fā)現(xiàn)激活的激酶網(wǎng)絡(luò)匯集到JAK1/2，WB驗證IFNγR1^KO細(xì)胞JAK1/2及其下游STAT3的磷酸化水平升高，而在IFNγR1^KO細(xì)胞重新表達(dá)Ifngr1后，JAK1/2磷酸化水平回調(diào)，說明黑色素瘤中IFN-γ信號的缺失與JAK1/2異常激活存在聯(lián)系。

JAK-STAT通路可能由胞外信號如IFN-γ、IFN-α/β、IL-6等激活。Il6、Il6r以及IFNαR1（IFN-α/β受體）在IFNγR1^KO細(xì)胞中表達(dá)升高，但I(xiàn)L-6和IL-6R抗體處理，或敲除Ifnar1均不能使IFNγR1^KO細(xì)胞的JAK1/2磷酸化水平降低，說明不是這些因素使JAK1/2激活。進(jìn)一步分析其他胞外因素，作者用IFNγR1^KO細(xì)胞的培養(yǎng)基上清處理對照黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)并不能誘導(dǎo)JAK2磷酸化水平上升，因此IFNγR1^KO細(xì)胞JAK1/2的激活更可能是胞內(nèi)事件的結(jié)果。

為了明確使JAK1/2的激活胞內(nèi)因素，作者對IFNγR1^KO和對照細(xì)胞進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序，利用差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析，并且進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究。這些分析均發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt和mTOR信號通路的顯著差異，WB驗證了IFNγR1^KO細(xì)胞中AKT和4E-BP1（mTOR下游）磷酸化水平升高。作者進(jìn)一步研究JAK1/2與mTOR通路的關(guān)系。mTOR抑制劑rapamycin (Rapa)處理IFNγR1^KO細(xì)胞顯著抑制JAK2磷酸化，而JAK1/2抑制劑ruxolitinib (Ruxo)處理后4E-BP1磷酸化水平不變，并且在IFNγR1^KO細(xì)胞中敲低mTOR也能使JAK1/2磷酸化回調(diào)。因此，在IFN-γ信號缺失的黑色素瘤細(xì)胞中，mTOR通路信號增強，并調(diào)控下游JAK1/2的激活。

上述結(jié)果提示IFN-γ信號缺失導(dǎo)致的ICB耐藥或許可以通過靶向mTOR-JAK1/2來解決，作者隨后在B6小鼠中進(jìn)行體內(nèi)驗證。在用Ruxo分別處理IFNγR1^KO和對照黑色素瘤小鼠模型后，發(fā)現(xiàn)Ruxo僅特異性抑制IFNγR1^KO黑色素瘤生長。盡管如此，體外實驗表明這一抑制作用并非由Ruxo對IFNγR1^KO細(xì)胞的直接殺傷所致。對體內(nèi)黑色素瘤的分析顯示，Ruxo能夠減少CD4⁺ TIL中T_reg細(xì)胞比例，增加TNF、IFN-γ、穿孔素、IL-2的分泌。而從未經(jīng)藥物處理的黑色素瘤中分離TIL進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ruxo處理降低FoxP3表達(dá)，增強TIL的效應(yīng)功能。以上結(jié)果表明Ruxo依賴于TIL發(fā)揮對IFN-γ信號缺失的黑色素瘤的抑制作用，而非直接殺傷腫瘤細(xì)胞。

為了評估T細(xì)胞在Ruxo治療中的作用，作者對接受Ruxo治療的IFNγR1^KO黑色素瘤小鼠進(jìn)行CD4或CD8中和抗體處理，發(fā)現(xiàn)任一種T細(xì)胞的缺失都使Ruxo的治療無效。在對Ruxo抑癌效應(yīng)機制的探究中，作者關(guān)注到TNF。IFNγR1^KO黑色素瘤細(xì)胞接種至TNF敲除（TNF^-/-）小鼠后，Ruxo不能將其抑制。對TIL的分析也發(fā)現(xiàn)，TNF^-/-小鼠中Ruxo處理不能使T_reg細(xì)胞比例下降，或使IFN-γ、IL-2等因子分泌增加。因此，Ruxo對IFNγR1^KO黑色素瘤的特異性抑制依賴于T細(xì)胞和TNF因子。

綜上所述，文章利用IFNγR1敲除的黑色素瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號缺失的黑色素瘤免疫微環(huán)境更不利于抑制腫瘤；結(jié)合激酶組、轉(zhuǎn)錄組、磷酸化蛋白質(zhì)組等多組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)此類黑色素瘤中mTOR通路信號增強，從而激活下游JAK1/2激酶；JAK或許可以作為IFN-γ信號缺失所致ICB耐藥的靶點，對臨床有一定的指導(dǎo)意義。

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