時(shí)間：2022-08-31 熱度：

?目前，手術(shù)、化療和放療是治療癌癥的主要方式，因個(gè)體化的差異導(dǎo)致很大一部分患者不能完全治愈^[1,2]。僅通過(guò)手術(shù)通常無(wú)法清除所有的癌細(xì)胞，而其他放療、化療等策略在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，往往會(huì)對(duì)正常組織造成嚴(yán)重的損害^[3,4]。因此，開發(fā)一種既能特異性殺傷癌細(xì)胞又不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成明顯損傷的策略，對(duì)癌癥治療具有重要的臨床意義。

不可修復(fù)的DNA損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，癌癥的放射治療正是利用了該原理，通過(guò)電離輻射對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)不可修復(fù)的DNA損傷，不過(guò)放療造成的DNA雙鏈斷裂(DSBs)是隨機(jī)的，不具有特異性，難以避免對(duì)正常細(xì)胞的損傷^[5,6]。

 

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新興的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在特定位點(diǎn)精準(zhǔn)創(chuàng)建DSBs^[7-9]。在高等真核生物中，DSBs會(huì)通過(guò)非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HR)修復(fù)途徑對(duì)其進(jìn)行修復(fù)^[10,11]。如果在抑制上述DNA修復(fù)通路的同時(shí)，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)僅對(duì)癌細(xì)胞特有的DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割，是否就能特異殺傷癌細(xì)胞了呢？這是海軍軍醫(yī)大學(xué)的研究者們創(chuàng)造性地提出的一個(gè)癌細(xì)胞特異性殺傷的構(gòu)想。并且該構(gòu)想被實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相關(guān)結(jié)果近期以“i-CRISPR：a personalized cancer therapy strategy through cutting cancer-specific mutations”為題，在線發(fā)表在國(guó)際權(quán)威期刊Molecular Cancer (IF=41.444) 上。海軍軍醫(yī)大學(xué)王越，楊彥勇，高福，韓超峰教授為文章的共同通訊作者，蔣俊鋒，陳媛媛和張莉為本文的并列第一作者。
 

 

研究提出的“i-CRISPR”策略，就是根據(jù)癌細(xì)胞的DNA序列，定制且導(dǎo)入僅能切割癌細(xì)胞DNA的CRISPR-Cas9系統(tǒng)——“癌細(xì)胞CRISPR剪刀”，造成癌細(xì)胞中DNA斷裂；同時(shí)添加DNA損傷修復(fù)抑制劑(DNA damage repair inhibitor, DSBRi)，使癌細(xì)胞中斷裂的DNA無(wú)法修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。DNA損傷修復(fù)抑制劑就是“i-CIRSPR”策略中的“i”，切割癌細(xì)胞DNA的“癌細(xì)胞CRISPR剪刀”就是“i-CIRSPR”策略中的“CRISPR”。 由于正常細(xì)胞中不含有可被“癌細(xì)胞CRISPR剪刀”切割的位點(diǎn)，因此其DNA不會(huì)被切割，便不會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷。如此，這種“i-CRISPR”策略有望實(shí)現(xiàn)既能特異性殺傷癌細(xì)胞又不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成明顯損傷的效果，該策略為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供了新的治療思路。 

結(jié)果

  

01“i-CRISPR”個(gè)性化癌癥治療策略的設(shè)計(jì)流程
 

Step 1

對(duì)患者的腫瘤樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞比較篩選獨(dú)特的DNA突變位點(diǎn)。

Step 2

設(shè)計(jì)特異性靶向癌細(xì)胞DNA突變位點(diǎn)的gRNA 用于開發(fā)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)。

Step 3

導(dǎo)入CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，同時(shí)加入DSBRi于細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷（圖1）。

 

圖1. “i-CRISPR”個(gè)性化癌癥治療策略流程圖

 

02“i - CRISPR”策略通過(guò)誘導(dǎo)相應(yīng)突變位點(diǎn)的DSBs殺死癌細(xì)胞

 

為了驗(yàn)證“i - CRISPR”策略，研究者首先通過(guò)全基因組測(cè)序分析了人肝癌細(xì)胞系HepG2的DNA序列，從1000多個(gè)潛在位點(diǎn)選取了8個(gè)候選靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)相應(yīng)的gRNA-Cas9，通過(guò)腺病毒載體導(dǎo)入HepG2細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在CRISPR基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入后，HepG2細(xì)胞的編輯位點(diǎn)發(fā)生了DSBs事件，且DSBs標(biāo)志物γH2AX表達(dá)顯著上升，然而經(jīng)過(guò)相同處理的Huh7細(xì)胞（無(wú)CRISPR基因編輯靶點(diǎn)）有較少的DSBs事件發(fā)生。

 

為了促進(jìn)DSBs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，研究人員使用靶向NHEJ（DNA-PKcs抑制劑NU7441）和HR（ATM抑制劑KU55933）修復(fù)的抑制劑^[12,13]處理細(xì)胞，DSBs修復(fù)被顯著抑制，且 NU7441 + Ku55933聯(lián)合處理HepG2細(xì)胞中觀察到更多未被修復(fù)的DSBs。此外，該策略采用gRNA-Cas9慢病毒系統(tǒng)導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞系DU145中，在更換了DNA損傷修復(fù)的抑制劑后也同樣獲得了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果，且不具有耐藥性。但對(duì)正常293T細(xì)胞（無(wú)CRISPR基因編輯靶點(diǎn)）的活力無(wú)抑制作用。

 

隨后，作者建立的類器官模型和人源腫瘤組織異種移植模型 (PDX)研究證明 “i - CRISPR”策略有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，小鼠體重、血生化以及血常規(guī)等數(shù)據(jù)也能夠證明該策略具有良好的生物安全性（圖2）。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用CRISPR技術(shù)對(duì)突變位點(diǎn)特異性基因編輯并結(jié)合DNA修復(fù)抑制劑可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，該策略在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

 

圖2. “i-CRISPR”策略特異有效殺傷癌細(xì)胞

 

03“i - CRISPR”策略殺傷細(xì)胞的分子機(jī)制

 

研究者利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)3組HepG2細(xì)胞進(jìn)行定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析來(lái)探索“i - CRISPR”策略對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷機(jī)制。結(jié)果顯示，在C-Cut組和NC組之間存在少量差異磷酸化蛋白，而在C-Cut-2i組中具有獨(dú)特且差異較大的磷酸化蛋白主要位于細(xì)胞核中。GO分析結(jié)果顯示，C-Cut組中改變的DNA損傷相關(guān)磷酸化蛋白水平增加并富集在染色質(zhì)組織和DNA損傷相關(guān)通路；C-Cut-2i組的差異磷酸化蛋白富集在自噬、鐵死亡、凋亡、壞死性凋亡等各種細(xì)胞死亡相關(guān)通路，尤其是自噬。因此，作者認(rèn)為自噬的激活在增加C-CUT-2i組細(xì)胞死亡的分子機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

 

通過(guò)全基因組甲基化測(cè)序(WGBS)結(jié)果證明gRNA-Cas9和DSBRis策略并沒(méi)有明顯改變細(xì)胞系中DNA甲基化相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控。但相較于對(duì)照細(xì)胞卻存在一些差異甲基化區(qū)域(DMRs)，且DMRs定位基因富集在細(xì)胞死亡、程序性細(xì)胞死亡和染色體組織以及凋亡通路中。

 

癌癥治療面臨的另一個(gè)難題是不斷突變的癌細(xì)胞的進(jìn)化。研究者對(duì)DU145的三個(gè)單克隆株A6（培養(yǎng)約60代）、B12和B13（培養(yǎng)約80代）分別進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)單克隆株在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生新的突變，呈現(xiàn)異質(zhì)性。但僅有少部分是其特有的(A6: 17.11%;B12: 32.10%;B13: 38.72%)，大多數(shù)原始突變得以保留。此外，本研究的DU145數(shù)據(jù)與公開的DU145突變數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比也證明超過(guò)一半的原始突變?nèi)匀槐Ａ簦▓D3）。

圖3. “i-CRISPR”策略殺傷細(xì)胞的分子機(jī)制

 

結(jié)論
 

研究表明：“i - CRISPR”策略可以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷，而對(duì)正常細(xì)胞不造成明顯損傷，并且，該策略在解決當(dāng)前癌癥治療所面臨的癌癥進(jìn)化問(wèn)題上也有很大的優(yōu)勢(shì)。隨著測(cè)序和克隆進(jìn)化分析等生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將從患者身上識(shí)別出所有癌細(xì)胞普遍存在的原始突變基因，解決癌癥異質(zhì)性帶來(lái)的問(wèn)題。通過(guò)CRISPR基因編輯系統(tǒng)結(jié)合DNA損傷修復(fù)抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性DSBs，加速細(xì)胞死亡，可作為腫瘤精準(zhǔn)治療的一種新策略，為個(gè)體化腫瘤治療提供新思路。

  
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