時間：2022-08-17 熱度：

前言

2022年7月，上海交通大學(xué)楊選明團(tuán)隊在Nature Communications發(fā)表“T cell receptor β-chain-targeting chimeric antigen receptor T cells against T cell malignancies”，該研究利用T細(xì)胞惡性腫瘤中T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）β鏈可變區(qū)的特異性，設(shè)計和構(gòu)建嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR），通過一系列體外和體內(nèi)實驗證明這一CAR-T細(xì)胞治療策略的安全性和有效性。

 

背景介紹

T細(xì)胞惡性腫瘤盡管在化療下緩解率較高，但許多患者腫瘤仍然會復(fù)發(fā)，而T細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，小分子靶向的治療方法難以開發(fā)，因此臨床急需新的治療策略。CAR-T細(xì)胞在B細(xì)胞來源的白血病中顯示出良好的治療效果，但用它治療T細(xì)胞惡性腫瘤依然面臨諸多困難。例如CAR-T細(xì)胞的制備過程中混有腫瘤細(xì)胞，以及CAR-T細(xì)胞自相殺傷，或殺傷正常T細(xì)胞。為避免這些問題，需要選擇腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的抗原。

 

在T細(xì)胞發(fā)育過程中，TCR多樣性來源于α鏈或β鏈可變-多樣-連接區(qū)結(jié)構(gòu)域（variable-diversity-joining-domain, VDJ-domain）的基因重排。TCR β鏈可變區(qū)的編碼基因包含52個Vβ片段，1個D片段和13個J片段，同時在人體中Vβ基因片段有24個家族，每個T細(xì)胞克隆三個區(qū)各僅選擇1個片段進(jìn)行組合，因此，正常TCR庫中單個特定TCR Vβ亞型的出現(xiàn)頻率大約在0.58-10.84%。而發(fā)展為T細(xì)胞惡性腫瘤的T細(xì)胞克隆較為單一，通常只有1個特定的TCR Vβ及Vα亞型。作者利用這一特異性區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常T細(xì)胞，并應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞設(shè)計。

 

研究思路
 

01  針對特定的Vβ亞型設(shè)計CAR-T細(xì)胞，檢測CAR-T細(xì)胞自身靶點表達(dá)，并通過與正常T細(xì)胞，以及Vβ8^-和Vβ8⁺配對細(xì)胞系共培養(yǎng)，檢測Vβ8-CAR-T細(xì)胞的殺傷表型。

02  在長期持續(xù)抗原刺激下檢測Vβ8-CAR-T細(xì)胞增殖、維持和殺傷能力。

03  在免疫缺陷小鼠模型中驗證Vβ8-CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果。

04  對靶向Vβ5的CAR-T細(xì)胞殺傷表型進(jìn)行重復(fù)驗證，拓寬策略適用范圍。

05  檢測特定亞型Vβ的T細(xì)胞缺失后對適應(yīng)性免疫的影響，驗證CAR-T治療策略安全性。

研究內(nèi)容
 

 首先，作者利用能夠特異性識別TCR β鏈可變區(qū)不同V區(qū)結(jié)構(gòu)域（Vβ8, Vβ5, Vβ13）的抗體，分析其氨基酸序列后提煉出相應(yīng)的單鏈可變片段（single-chain variable fragment, scFv），并將該序列與4-1BB和CD3ζ序列整合構(gòu)建CAR，用激活的原代T細(xì)胞制備靶向不同Vβ亞型的CAR-T細(xì)胞。對這些CAR-T細(xì)胞自身分別檢測特定Vβ亞型陽性率，發(fā)現(xiàn)這些CAR-T細(xì)胞確實能特異性消除各自靶向的Vβ亞型陽性的正常T細(xì)胞，而對總Tαβ表達(dá)沒有影響。將Vβ8特異的CAR-T細(xì)胞與正常T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Vβ8⁺ T細(xì)胞類群比例明顯下降，并且上清檢測出細(xì)胞毒性相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α分泌顯著增多。

 

接下來，作者利用293細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞分別構(gòu)建配對的Vβ8^-和Vβ8⁺細(xì)胞，并與對照T細(xì)胞或Vβ8-CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)Vβ8⁺細(xì)胞與Vβ8-CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)時，才能檢測到T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α的釋放，以及granzyme B的表達(dá)，Vβ8⁺ Jurkat細(xì)胞才能被特異性殺傷，并且激活的caspase-3表達(dá)水平顯著上升，表明細(xì)胞凋亡增加。

 

 

為了檢測CAR-T細(xì)胞長期增殖和細(xì)胞毒性殺傷能力，作者利用輻照的Vβ8⁺ Raji細(xì)胞作為抗原持續(xù)重復(fù)刺激Vβ8-CAR-T細(xì)胞。通過檢測多個不同供體來源的CAR-T細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)的抗原刺激能夠不斷增加Vβ8-CAR-T細(xì)胞數(shù)目，無需為T細(xì)胞擴(kuò)增做額外的基因改造，也沒有出現(xiàn)靶向CD3或CD5的CAR-T細(xì)胞中互相殺傷的現(xiàn)象。而細(xì)胞毒性檢測實驗表明，與對照T細(xì)胞相比，不同刺激階段的Vβ8-CAR-T細(xì)胞均能顯著提升對Vβ8⁺ Jurkat細(xì)胞的殺傷。

 

 

作者進(jìn)一步在體內(nèi)驗證Vβ8-CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效果，他們用免疫缺陷的NSG小鼠建立Jurkat細(xì)胞異種移植模型，靜脈注射對照T細(xì)胞或者Vβ8-CAR-T細(xì)胞，結(jié)果表明經(jīng)Vβ8-CAR-T細(xì)胞治療的小鼠，流式檢測其外周血、脾臟和骨髓中的腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯降低，活體成像顯示各時間點腫瘤負(fù)荷明顯減少，總生存率顯著提升。

 

 

利用Vβ8靶點證明靶向Vβ的策略有效后，作者并不滿足于此，希望將適用范圍拓展到其他T淋巴細(xì)胞腫瘤。為此，作者構(gòu)建了Vβ5-CAR-T細(xì)胞，以及Vβ5陽性的腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM和Hut-78 T細(xì)胞系。與靶向Vβ8的實驗結(jié)果一致，在Vβ5-CAR-T細(xì)胞制備的過程中，自身表達(dá)Vβ5的正常T細(xì)胞被清除。體外共培養(yǎng)實驗中，Vβ5-CAR-T細(xì)胞能夠特異性殺傷Vβ5⁺的CCRF-CEM和Hut-78 T細(xì)胞，并且僅在它與Vβ5⁺細(xì)胞共培養(yǎng)時分泌IFNγ。同樣在體內(nèi)實驗中，Vβ5-CAR-T細(xì)胞注射能夠顯著降低Vβ5⁺的CCRF-CEM異種移植腫瘤負(fù)荷，并且顯著延長荷瘤小鼠生存期。

 

 

靶向Vβ的策略雖然顯示較好的抗腫瘤效果，但仍存在一定風(fēng)險，CAR-T細(xì)胞會攻擊自身表達(dá)所靶向Vβ亞型的正常T細(xì)胞，故作者接下來對這一策略安全性進(jìn)行評估。因為體內(nèi)某特定Vβ亞型的T細(xì)胞僅占所有T細(xì)胞的一小部分，作者猜測相比于靶向所有T細(xì)胞（例如CD5、CD7或CD3）的CAR-T治療策略，這一小部分T細(xì)胞的缺失不會產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制。為了驗證這一猜想，作者建立了選擇性去除Vβ8⁺ T細(xì)胞的小鼠模型。Vβ8特異性抗體的檢測表明小鼠中Vβ8⁺ T細(xì)胞約占總正常T細(xì)胞的21.5%。作者利用相同scFv片段制備Vβ8重組抗體，模擬長期Vβ8⁺ T細(xì)胞的缺失，并用CD3ε抗體處理的小鼠作為陽性對照。

 

隨后作者對該小鼠模型注射DEC-OVA疫苗，發(fā)現(xiàn)Vβ8抗體處理的小鼠產(chǎn)生DEC-OVA抗體的水平，以及OT-I特異的T細(xì)胞應(yīng)答水平與野生型小鼠類似，而CD3ε抗體處理的小鼠產(chǎn)生的DEC-OVA抗體顯著減少，OT-I特異的T細(xì)胞應(yīng)答則完全被抑制。作者進(jìn)一步對接種B16-OVA腫瘤細(xì)胞的小鼠進(jìn)行抗腫瘤免疫檢測，發(fā)現(xiàn)Vβ8⁺ T細(xì)胞缺失小鼠的腫瘤生長曲線與野生型小鼠基本一致，而由CD3ε抗體處理后所有T細(xì)胞缺失的小鼠腫瘤生長更加迅速。因此Vβ8⁺ T細(xì)胞缺失的小鼠細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)幾乎不受影響。

 

 

 綜上所述，文章利用TCR β鏈可變區(qū)的特定亞型作為靶點，建立特異性的CAR-T細(xì)胞治療策略，并證明該策略能夠有效殺傷特定亞型的T細(xì)胞惡性腫瘤，同時保留充分的適應(yīng)性免疫功能，對臨床有一定的指導(dǎo)意義。

九游會j9生物憑借多年技術(shù)積累，基于基礎(chǔ)的病毒服務(wù)和公司自有的細(xì)胞、動物平臺，九游會j9可以為您提供慢病毒包裝、細(xì)胞株構(gòu)建、流式分析及分選、小鼠移植瘤模型構(gòu)建和包括活體成像在內(nèi)的各種動物操作服務(wù)，為您提供文中涉及的多種研究支持。