Pre-mRNA剪接是轉(zhuǎn)錄后的一個(gè)過(guò)程，可由單個(gè)基因產(chǎn)生多個(gè)mRNA亞型。由于mRNA決定了蛋白質(zhì)的序列和功能，剪接過(guò)程有可能擴(kuò)大編碼蛋白質(zhì)的種類。Pre-mRNA的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，特定mRNA的相對(duì)豐度取決于剪接環(huán)境。RNA測(cè)序表明，超過(guò)90%的人類編碼蛋白質(zhì)的基因會(huì)通過(guò)pre-mRNA剪接去除內(nèi)含子，內(nèi)含子保留是一種常見(jiàn)的異常剪接類型。已有研究證明具有剪接功能的某些RNA結(jié)合蛋白（RBP)失調(diào)會(huì)促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

NONO，是一種非POU結(jié)構(gòu)域的八聚體結(jié)合蛋白，屬于DBHS蛋白家族。與許多RBP相似，NONO通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮其多種功能，參與不同的生理和病理過(guò)程。例如，NONO參與cGAS介導(dǎo)的先天免疫激活，在免疫通路中直接結(jié)合病毒衣殼，修復(fù)DNA損傷以及維持端粒穩(wěn)態(tài)。此外，NONO在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后不同階段的調(diào)控是至關(guān)重要的。NONO還協(xié)調(diào)代謝基因pre-mRNA的加工，尤其是內(nèi)含子的去除。

然而，NONO的功能在RNA剪接和癌癥的發(fā)生發(fā)展中還需要進(jìn)一步的闡述，特別是在GBM中，這是迄今尚不明確的。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的過(guò)度激活導(dǎo)致需要處理的pre-mRNA增加，并且最近的研究報(bào)道了許多影響癌癥進(jìn)展的異常剪接事件。因此，剪接因子是未來(lái)癌癥治療的潛在治療靶點(diǎn)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的治療。然而，在GBM中內(nèi)含子剪接異常的保留機(jī)制尚不明確。

 

近期，山東大學(xué)李新鋼和王劍教授的腦科學(xué)團(tuán)隊(duì)在Theranostics雜志上發(fā)表題為Targeting the splicing factor NONO inhibits GBM progression through GPX1 intron retention的文章，研究揭示了剪接因子NONO在GBM進(jìn)展中的作用，以及靶向剪接因子來(lái)治療GBM的可能性。

結(jié)果

01 剪接因子NONO在GBM中高表達(dá)

研究者通過(guò)公開(kāi)的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，在具有mRNA剪接功能的355個(gè)蛋白中鎖定治療GBM的潛在靶點(diǎn)剪接因子NONO。NONO在GBM中表達(dá)顯著高于正常腦組織，且其表達(dá)量與WHO腫瘤的分級(jí)相關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示NONO的核定位與其剪接因子的作用相一致。綜合分析表明NONO在GBM中高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后較差（圖1）。

圖1 剪接因子NONO在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤分級(jí)相關(guān)

02 剪接因子NONO影響GBM的生長(zhǎng)

為了確定NONO在GBM發(fā)生中的潛在作用，研究人員通過(guò)siRNA和shRNA敲除細(xì)胞中的NONO。體外實(shí)驗(yàn)證明NONO的丟失會(huì)導(dǎo)致GBM細(xì)胞系（U251）和GBM患者來(lái)源的原代細(xì)胞（P3）增殖減少，遷移與侵襲能力降低，并且細(xì)胞發(fā)生凋亡。在小鼠體內(nèi)原位異種移植U251-和P3-shNONO/NC細(xì)胞，經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，移植shNONO的細(xì)胞生長(zhǎng)顯著降低，細(xì)胞增殖減少，且荷瘤小鼠的總生存期得以延長(zhǎng)。綜上所述，NONO的缺失抑制腦膠質(zhì)瘤增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制了GBM侵襲和自我更新（圖2）。

圖2 敲除NONO可抑制GBM細(xì)胞系的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

進(jìn)一步利用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NONO的LN229和P3細(xì)胞。CCK8、EdU、克隆形成、遷移和侵襲等體外實(shí)驗(yàn)表明，NONO過(guò)表達(dá)促進(jìn)LN229和P3細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。此外，在體內(nèi)過(guò)表達(dá)NONO促進(jìn)LN229-和P3異種移植瘤的生長(zhǎng)，并顯著縮短小鼠的生存期（圖3）。

圖3 NONO過(guò)表達(dá)促進(jìn)GBM的增殖和侵襲

03 剪接因子NONO通過(guò)與PSPC1相互作用介導(dǎo)GPX1剪接

為了探索NONO參與GBM發(fā)生的機(jī)制，研究者對(duì)U251和P3-siNONO/NC細(xì)胞進(jìn)行了高通量RNA-seq分析。結(jié)果顯示，NONO會(huì)影響細(xì)胞中內(nèi)含子-外顯子連接的整體剪接效率，并在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)GBM表達(dá)數(shù)據(jù)中進(jìn)一步鎖定并分析到GPX1和CCN1的表達(dá)水平以及剪接效率下降的情況。結(jié)果表明，NONO介導(dǎo)了GPX1和CCN1的內(nèi)含子剪接，影響二者在蛋白水平的表達(dá)。NONO的缺失導(dǎo)致GPX1和CCN1基因在mRNA水平顯著降低，但pre-mRNA水平保持不變或略有升高。后續(xù)結(jié)果驗(yàn)證了NONO直接結(jié)合pre-mRNA中的內(nèi)含子來(lái)介導(dǎo)GPX1和CCN1的剪接而非成熟的mRNA，并且在細(xì)胞核中觀察到GPX1的pre-mRNA與NONO的共定位現(xiàn)象。因此，研究者將進(jìn)一步探索GPX1在NONO下游的功能（圖4）。

圖4 GPX1和CCN1的表達(dá)受NONO介導(dǎo)的pre-mRNA剪接調(diào)控

GPX1是人體最重要的抗氧化酶之一，可催化過(guò)氧化氫與谷胱甘肽反應(yīng)，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)。研究人員基于RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了GO富集分析，NONO的敲除與誘導(dǎo)活性氧的反應(yīng)有關(guān)。細(xì)胞水平NONO被敲除后，GPX活性被顯著抑制、ROS水平增加，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體活性降低。挽救實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)GPX1的過(guò)表達(dá)可以部分修復(fù)GBM細(xì)胞系中由于NONO敲除所帶來(lái)的不良影響（圖5）。

圖5 NONO的丟失通過(guò)GPX1途徑引起氧化還原失衡

隨后NONO各結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)GPX1表達(dá)過(guò)程中的作用引起了研究者的興趣，首先對(duì)NONO蛋白3個(gè)結(jié)構(gòu)域（RRM1、RRM2、DBHS）分別進(jìn)行突變，構(gòu)建NONO-wt與3個(gè)NONO-mut的U251細(xì)胞。結(jié)果顯示只有RRM1-mut對(duì)GPX1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，而RRM2-和DBHS-mut的細(xì)胞活力顯著降低，且RRM2結(jié)構(gòu)域是NONO與pre-mRNA結(jié)合所必需的。為了進(jìn)一步研究DBHS-mut細(xì)胞活力降低的原因，通過(guò)CoIP分析，最后證實(shí)了PSPC1與NONO的DBHS結(jié)構(gòu)域相互作用，并且PSPC1在NONO介導(dǎo)的GPX1剪接過(guò)程中是必需的（圖6）。

圖6 PSPC1協(xié)助NONO的RRM2結(jié)構(gòu)域與GPX1 pre-mRNA結(jié)合并進(jìn)行剪接

04 Auranofin，是一種治療GBM的潛在分子藥物

FDA批準(zhǔn)的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物Auranofin曾報(bào)道具有抗癌活性，也被發(fā)現(xiàn)可以抑制GBM中的GPX1。于是，研究者進(jìn)行了體外SPR分析，發(fā)現(xiàn)Auranofin和NONO可以直接結(jié)合并且具有較大的親和力。細(xì)胞耐藥試驗(yàn)證明Auranofin通過(guò)下調(diào)NONO和GPX1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)特異性影響GBM腫瘤細(xì)胞活力，且Auranofin對(duì)GPX1的抑制是由NONO所介導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致線粒體功能下降，并且能夠抑制GBM細(xì)胞的侵襲。基于體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在裸鼠體內(nèi)建立P3原位異種移植瘤，Auranofin顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)腫瘤承載動(dòng)物的生存期。異種移植組織病理結(jié)果顯示NONO和GPX1表達(dá)降低，細(xì)胞增殖降低（圖7）。

圖7 Auranofin通過(guò)NONO-GPX1途徑抑制GBM

結(jié)論

該研究通過(guò)對(duì)正常細(xì)胞系、癌癥細(xì)胞系以及原代細(xì)胞中的NONO等基因進(jìn)行干擾/過(guò)表達(dá)（慢病毒）。通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明了剪接因子NONO的過(guò)表達(dá)（慢病毒）促進(jìn)了GBM的進(jìn)展，而抑制NONO（慢病毒、shRNA）會(huì)導(dǎo)致GPX1中內(nèi)含子的保留，進(jìn)而導(dǎo)致ROS增加，細(xì)胞凋亡和侵襲抑制。此外，Auranofin可能通過(guò)靶向NONO介導(dǎo)的GPX1剪接表現(xiàn)出抗癌活性，Auranofin可能成為GBM患者的一種新的治療藥物，成為一種新的治療策略。  

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院李新鋼教授、王劍教授和陳安靜研究員為本文的共同通訊作者，課題組博士研究生王旭為論文第一作者，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院為第一作者單位和通訊作者單位。

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