共濟失調（Ataxia）是一類以運動協(xié)調性紊亂為主要特征的神經系統(tǒng)疾。俅脖硐職ú教晃、喪失平衡、吞咽困難、眼球運動異常、肌張力受損等。小腦功能障礙是導致共濟失調發(fā)生的重要致病因素之一。
浦肯野細胞（Purkinje cell, PC）是小腦皮質中主要的GABA能神經元，也是從小腦皮質發(fā)出的唯一能夠傳出沖動的神經元。研究發(fā)現(xiàn)，小腦浦肯野神經元變性參與共濟失調的發(fā)生發(fā)展過程。然而，參與共濟失調的特異性投射環(huán)路及其潛在的病理機制仍不清楚。
2022年6月1日，南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院盧應梅教授課題組與藥學院韓峰教授課題組合作在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志在線發(fā)表最新研究論文“BOD1 regulates the cerebellar IV/V lobe-fastigial nucleus circuit associated with motor coordination”。此項研究首次報道了小腦IV/V葉到小腦頂核（Fastigial Nucleus，F(xiàn)N）投射環(huán)路異常是導致共濟失調發(fā)生的重要病因之一，揭示了基于BOD1相關信號通路所導致的小腦IV/V葉浦肯野神經元至其下游投射的小腦頂核谷氨酸能神經元環(huán)路（IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+）異常在共濟失調發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制。為探索預防共濟失調等相關運動系統(tǒng)疾病的神經調控手段及臨床治療的分子藥物靶點開發(fā)提供了強有力的依據(jù)。
小腦IV/V葉浦肯野細胞到FN CaMKIIα陽性神經元存在單突觸投射
小腦頂核（Fastigial Nucleus，F(xiàn)N）可通過接受小腦皮質投射或發(fā)出神經纖維至大腦不同區(qū)域在協(xié)調運動中發(fā)揮關鍵作用。基于此，研究者借助病毒示蹤技術和染料示蹤技術明確小腦葉與FN之間的投射關系。
首先，作者將紅色逆行示蹤染料注射至WT小鼠FN，7天后發(fā)現(xiàn)，小腦IV/V葉到FN有投射通路（圖1a）。隨后，將順行示蹤病毒AAV-DIO-EGFP注射L7-Cre鼠（特異性在浦肯野細胞表達Cre）小腦IV/V葉，發(fā)現(xiàn)小腦IV/V葉浦肯野細胞（Purkinje cell, PC）到FN CaMKIIα陽性神經元之間的特異性投射（圖1b-e）。進一步，作者借助逆行示蹤病毒證實了IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路（圖1f-i）。
為表征IV/V葉到FN之間的突觸連接，研究者將AAV-CaMKIIα-EGFP注射L7-Cre鼠FN，AAV-DIO-ChR2-mCherry注射IV/V葉。膜片鉗記錄顯示，光遺傳激活IV/V葉到FN的投射末端可導致FN CaMKIIα陽性神經元產生誘發(fā)性抑制性突觸后電流（evoked inhibitory postsynaptic currents, eIPSCs），提示了小腦IV/V葉與FN CaMKIIα陽性神經元存在單突觸投射（圖1j-m）。
圖1 IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路
特異性抑制IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路可導致共濟失調樣行為
為研究IV/V葉—FN環(huán)路在運動相關行為中的作用，研究者在L7-Cre鼠IV/V葉注射AAV-DIO-eNpHR3.0-mCherry病毒，對腦片進行全細胞膜片鉗記錄發(fā)現(xiàn)，光遺傳抑制降低了IV/V葉浦肯野細胞的放電速率（圖2a-e）。此外，多種行為學結果顯示，光遺傳抑制IV/V葉在FN的投射末端可誘發(fā)小鼠共濟失調樣行為（圖2h-k）。同時，作者借助化學遺傳學技術進一步驗證了特異性抑制IV/V葉浦肯野細胞，可導致FN CaMKIIα陽性神經元過度激活，從而損傷小鼠運動協(xié)調能力，產生共濟失調樣行為。
圖2 光遺傳抑制IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射通路可導致共濟失調樣行為
為探討IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射功能異常的分子機制。研究人員通過轉錄組分析、GTEx（Genotype-Tissue Expression，基因型-組織表達）數(shù)據(jù)庫和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，BOD1在小腦浦肯野細胞中高表達（圖3a-e）。
接下來，作者構建L7-Cre; BOD1f/f小鼠以確定特異性在浦肯野細胞中敲除BOD1基因對共濟失調的影響。經多種行為學范式顯示，L7-Cre; BOD1f/f小鼠出現(xiàn)共濟失調樣表型（圖3f-m）。
圖3 特異性敲除浦肯野細胞中BOD1可導致共濟失調
進一步，研究者借助AAV載體攜帶浦肯野細胞特異性啟動子（AAV-L7-Cre-EGFP）條件性在小腦IV/V葉浦肯野細胞敲除BOD1，發(fā)現(xiàn)下調IV/V葉中BOD1的表達，可降低浦肯野細胞興奮性，誘發(fā)小鼠表現(xiàn)出運動相關行為障礙（圖4a-k）。
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究人員分別在L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉注射AAV-DIO-hM3Dq-mCherry病毒，借助化學遺傳學技術激活浦肯野細胞，發(fā)現(xiàn)經CNO藥物處理后，可改善由BOD1缺陷導致的小鼠共濟失調樣行為（圖4l-p）。這些結果提示了，BOD1缺失影響小腦IV/V葉浦肯野細胞活性，導致IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射功能異常，進而誘發(fā)小鼠共濟失調樣行為。
圖4 BOD1調控IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路
BOD1相關信號通路介導IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+異常導致共濟失調的分子機制
接下來，研究者借助稀疏標記病毒發(fā)現(xiàn)特異性敲除IV/V葉浦肯野神經元中BOD1可導致浦肯野細胞樹突棘密度和樹突分支明顯降低。為研究其機制，作者分別在L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉注射AAV-L7-EGFP，借助流式分選結合單細胞轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，BOD1通過調節(jié)樹突和樹突棘相關基因影響浦肯野細胞樹突形態(tài)發(fā)生改變（圖5）。
圖5 BOD1通過調節(jié)樹突和樹突棘相關基因影響浦肯野細胞樹突形態(tài)發(fā)生改變
最后，研究者將AAV-DIO-BOD1-mCherry注射于L7-Cre鼠和L7-Cre; BOD1f/f小鼠IV/V葉，發(fā)現(xiàn)上調BOD1的表達可增加IV/V葉浦肯野細胞興奮性，逆轉FN CaMKIIα陽性神經元異常放電現(xiàn)象，改善浦肯野細胞樹突形態(tài)和共濟失調樣行為（圖6）。
綜上，IV/V葉浦肯野細胞中BOD1缺失通過調節(jié)樹突和樹突棘相關基因導致樹突棘密度和樹突分支降低，進而引起其活性下降，并通過影響IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路，引起FN CaMKIIα陽性神經元異常放電，最終誘發(fā)共濟失調發(fā)生。
圖6 上調IV/V葉浦肯野細胞中BOD1的表達可改善小鼠共濟失調樣行為
本文借助轉基因小鼠、病毒示蹤技術、膜片鉗記錄、光遺傳學、化學遺傳學、多種行為學范式、Cre-Loxp系統(tǒng)介導的條件性基因敲除、轉錄組分析等多種技術手段發(fā)現(xiàn)小腦IV/V葉浦肯野細胞中BOD1缺失可通過調節(jié)樹突和樹突棘相關基因導致樹突棘密度和樹突分支降低，進而引起其活性下降，并通過影響IV/V lobePCs—FNCaMKIIα+投射環(huán)路，引起FN CaMKIIα陽性神經元異常放電，最終誘發(fā)共濟失調發(fā)生。此項研究找到了一條特異性介導共濟失調發(fā)生的神經環(huán)路，為探索預防相關疾病的神經調控手段及臨床治療的分子藥物靶點開發(fā)提供了強有力的依據(jù)。
南京醫(yī)科大學藥學院劉秀秀博士為該論文的第一作者，南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院盧應梅教授和藥學院韓峰授為共同通訊作者。
九游會j9生物有幸為研究者提供浦肯野細胞（L7）特異性啟動子、光遺傳、化學遺傳學、Cre等AAV病毒載體，助力神經科學研究！
