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慢病毒

慢病毒載體

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慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒可將外源基因整合到基因組中實現(xiàn)穩(wěn)定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。

　　慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

　　圖1 慢病毒包裝和侵染細胞的過程

　　慢病毒載體具有宿主范圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長期表達等特點。能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，達到持久性表達，因而可構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，用于基因的細胞功能研究。借助慢病毒載體改造T細胞可用于CAR-T細胞治療。

慢病毒包裝與純化

　　慢病毒包裝采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒系統(tǒng)進行包裝，收集細胞培養(yǎng)上清，通過超速離心濃縮純化和收集病毒。

慢病毒滴度檢測

　　檢測方法：定量PCR檢測感染后細胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)

　　實驗原理：慢病毒介導外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進目的細胞基因組

慢病毒載體優(yōu)勢

① 表達時間長：慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上，實現(xiàn)基因長時間穩(wěn)定的表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，是細胞實驗的首選，常用于構(gòu)建穩(wěn)定株。
② 安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細胞用于CAR-T細胞治療。
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗。

不同病毒的生物學特性比較

載體選擇
　　九游會j9生物擁有豐富的慢病毒產(chǎn)品，用于操作編碼基因和非編碼基因，如lncRNA、microRNA、circRNA，如下慢病毒載體可供您選擇（不限于此列表）：

調(diào)控方式	載體編號	載體名稱（載體元件順序）	真核抗性	熒光	啟動子	默認標簽	載體容量
過表達	GL127	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE	N/A	EGFP	CMV	3FLAG	4.8kb
	GL121	pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE	N/A	EGFP	CMV	N/A	4.4kb
	GL129	pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE	N/A	mCherry	CMV	3FLAG	4.8kb
	GL119	pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE	Puro	N/A	CMV	3FLAG	4.4kb
	GL120	pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE	Puro	EGFP	CMV	3FLAG	3.5kb
	GL107	pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE	Puro	EGFP	CMV	3FLAG	3.7kb
	GL109	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE	Puro	EGFP	CMV	N/A	3.8kb
	GL122	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE	blasticidin	EGFP	CMV	N/A	3.9kb
	GL130	pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE	Puro	EGFP	CMV	3FLAG	3.7kb
	GL132	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS	Puro	EGFP	CMV	N/A	3.7kb
	GL123	pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE	Puro	mCherry	CMV	3FLAG	3.7kb
	GL125	pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE	Puro	mCherry	CMV	3FLAG	3.7kb
	GL133	pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS	Puro	mCherry	CMV	N/A	3.7kb
	H114	pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE	Puro	N/A	CMV	N/A	2.2kb
	GL124	pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE	Puro	N/A	CMV	N/A	2.8kb
表達cre	H126	pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE	N/A	N/A	CMV	3FLAG	3.9kb
表達cre	H15108	pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE	N/A	N/A	CMV	3FLAG	5.3kb
三標	H7656	pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE	Puro	mNeonGreen	CBh	3FLAG	1.3kb
	H7657	pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE	Puro	tdTomato	CBh	3FLAG	0.6kb
	H9911	pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE	blasticidin	mNeonGreen	CBh	3FLAG	1.5kb
	H9912	pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE	blasticidin	tdTomato	CBh	3FLAG	0.8kb
circRNA過表達	H8384	pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE	N/A	EGFP	CMV	N/A	3.0kb
	H8807	pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE	N/A	N/A	CMV	N/A	4.8kb
	H8399	pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE	Puro	EGFP	CMV	N/A	1.0kb
	H8810	pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE	N/A	N/A	CMV	N/A	2.8kb
miRNA過表達	GL109	pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE	Puro	EGFP	CMV	N/A	N/A
	H3919	pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE	Puro	EGFP	U6	N/A	N/A
	H119	pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE	Puro	TurboGFP	CMV	N/A	N/A
	H3928	pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE	Puro	mCherry	U6	N/A	N/A
	H146	pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE	Puro	EGFP	CMV	3FLAG	N/A
	H7505	pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE	blasticidin	EGFP	CMV	N/A	N/A
	H7506	pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE	Puro	EGFP	CMV	N/A	N/A
過表達（Tet-on）	H125	pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE	Puro	EGFP	TRE	N/A	2.0kb
	H121	pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE	Puro	EGFP	TRE	3FLAG	3.3kb
	H2057	pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE	Puro	N/A	EF1	N/A	N/A
shRNA干擾	GL401	pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE	Puro	N/A	U6	N/A	N/A
	GL404	pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE	N/A	EGFP	U6	N/A	N/A
	GL427	pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE	Puro	EGFP	U6	N/A	N/A
	GL428	pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE	Puro	mCherry	U6	N/A	N/A
	H7615	pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE	blasticidin	mCherry	U7	N/A	N/A
CRISPR敲除	H5070	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE	Puro	N/A	U6	N/A	N/A
	H7072	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE	blasticidin	N/A	U6	N/A	N/A
	H6825	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE	N/A	sfGFP	U6	N/A	N/A
	H5068	pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE	N/A	EGFP	U7	N/A	N/A
	H5450	pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE	Puro	N/A	CMV	3FLAG	N/A
CRISPRa轉(zhuǎn)錄激活	H9517	pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE	blasticidin	N/A	U6	N/A	N/A
	E2577	pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE	hygromycin	N/A	EF1a	N/A	N/A
	H7284	pCLenti-U6-gRNA-2x(wt+f6)MS2-CMV-MCP-P65-HSF1-IRES-BSR-WPRE	blasticidin	N/A	U6/CMV	N/A	N/A
	H7281	pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE	Puro	N/A	CMV	N/A	N/A

常規(guī)應用

　　體外感染細胞

　　慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，因而可以達到持久性表達，從而構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，體外進行細胞功能學實驗，包括細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡等研究。穩(wěn)定表達目的基因的腫瘤細胞株還可以進一步構(gòu)建腫瘤動物模型，進行體內(nèi)基因功能驗證，藥效藥代，活體成像等檢測，進一步研究體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移及藥物治療的效果。

　　常見MOI列表

細胞名	中文名稱	慢病毒感染MOI （參考值）
MGC80-3	人胃癌細胞	10
HT-29	人結(jié)腸癌細胞	20
RKO	人結(jié)腸腺癌細胞	10
Caki-1	人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞	10
5637	人膀胱癌細胞	10
U-118 MG	人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤	10
RWPE-1	人正常前列腺上皮細胞	20
HeLa	人宮頸癌細胞	10~20
Ca Ski	人宮頸癌腸轉(zhuǎn)移細胞	10
MCF7 [MCF-7]	人乳腺癌細胞	10
A549	人非小細胞肺癌細胞	10
NCI-H1299	人非小細胞肺癌細胞	20
U-87 MG	人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤	10
U251	人膠質(zhì)瘤細胞	10
A172	人膠質(zhì)母細胞瘤細胞	10
K-562	人慢性髓原白血病細胞	10
HL-60	人原髓細胞白血病細胞	10
GES-1	人胃上皮細胞	20
U266	人骨髓瘤細胞	20
CAL 27	人舌鱗癌細胞	20
PC9	人肺癌細胞	5
PC14	人肺癌細胞	10
MADB-106	大鼠乳腺癌細胞	20
F98	大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞	20
MHCC-97H	人肝癌細胞（高轉(zhuǎn)移）	10~20

　
　　MOI 是multiplicity of infection 的縮寫，即感染復數(shù)，其含義是感染時病毒與細胞的數(shù)量比值，一般以實驗中某個細胞，感染達到80%，定義為這個細胞的MOI值，即病毒量與細胞數(shù)的比值；加的病毒量(μl)=細胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000

慢病毒在腫瘤研究中的應用案例

1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 膠質(zhì)細胞瘤]
慢病毒干擾： Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1

2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒過表達/干擾：pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro

慢病毒在神經(jīng)系統(tǒng)的應用（在體注射）
1．Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 學習與記憶]

病毒類型：慢病毒
載體名稱：LV-Suv39h1-RNAi（不確定詳細的）
注射部位：海馬DG區(qū)
病毒注射量：2 μL，9.98 × 10⁸ TU/mL
檢測時間：2周

2．Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神經(jīng)環(huán)路]

病毒類型：慢病毒
載體名稱：LV- CX36-shRNA-EGFP（不確定詳細的）
注射部位：P1小鼠新皮層L1
病毒注射量：1μL
檢測時間：2周
3．Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自閉癥]

病毒類型：慢病毒
載體名稱：Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位：小鼠海馬CA1區(qū)
病毒注射量：1μL
檢測時間：4周

慢病毒延伸服務

九游會j9生物慢病毒的生產(chǎn)和質(zhì)控采取了國際學術(shù)界公認的標準流程，采用三質(zhì)?；蛩馁|(zhì)粒系統(tǒng)在293T細胞中進行包裝。所獲得的病毒顆粒經(jīng)過超速離心純化，并通過qPCR對病毒基因拷貝進行滴定。一般情況下九游會j9的慢病毒的滴度在10⁸~10⁹TU/ml，完全可以滿足各類實驗的使用要求。
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