2019年8月，《Molecular Therapy》雜志刊登了Afrooz Rashnonejad研究組最新工作[3]，他們借助血清型為9型的腺相關(guān)病毒載體(rAAV9)向胚胎期小鼠遞送SMN基因，增加了治療后出生小鼠體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量及SMN蛋白表達(dá)，延長(zhǎng)其壽命。這一研究成果為胎兒基因治療SMA提供了有效的基礎(chǔ)研究支持，是胎兒基因治療取得的一個(gè)重要進(jìn)展。
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rAAV9介導(dǎo)基因通過(guò)宮內(nèi)側(cè)腦室注射在小鼠體內(nèi)的表達(dá)分布首先，研究人員比較AAV9-EGFP兩種不同的子宮內(nèi)(The intrauterine, IU)注射方式：胎盤(pán)注射(intraplacental，IP)和側(cè)腦室注射(intracerebroventricular，i.c.v)的轉(zhuǎn)染效率，并在新生鼠出生后第一天(P1)和第十四天(P14)利用成像系統(tǒng)(IVIS)觀(guān)察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的增加，兩組幼鼠肩胛間區(qū)EGFP熒光信號(hào)水平表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，此外，接受側(cè)腦室注射的幼鼠在P1檢測(cè)到大腦中有最高水平的EGFP熒光信號(hào)，并在P14檢測(cè)到脊髓中EGFP高表達(dá)，同時(shí)，接受胎盤(pán)注射的幼鼠在肝臟和腹股溝處EGFP表達(dá)水平較高(圖1B)。
在P30進(jìn)行免疫熒光結(jié)果顯示，兩周幼鼠的大腦和脊髓處均發(fā)現(xiàn)EGFP廣泛表達(dá)(圖1C,D)。與胎盤(pán)注射相比，側(cè)腦室注射以很高的效率轉(zhuǎn)導(dǎo)幼鼠脊髓(圖1C)及大腦皮層、海馬DG區(qū)和脈絡(luò)叢(圖1D)。
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，相較于胎盤(pán)注射，將AAV9-EGFP通過(guò)側(cè)腦室注射，使熒光蛋白在小鼠皮層神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上的表達(dá)較高，提示了通過(guò)側(cè)腦室注射，AAV9-EGFP更傾向于感染神經(jīng)元(圖2)。
隨后，研究人員借助Western blot分析發(fā)現(xiàn)，通過(guò)側(cè)腦室注射使EGFP蛋白在脊髓、皮層、海馬等腦區(qū)的表達(dá)量明顯高于胎盤(pán)注射的，然而，在丘腦的表達(dá)量明顯低于胎盤(pán)注射的，提示了將病毒載體介導(dǎo)的EGFP蛋白通過(guò)側(cè)腦室注射到胎兒的大腦中，該病毒進(jìn)入腦脊液(CSF)，并以很高的效率轉(zhuǎn)導(dǎo)大腦及脊髓中的神經(jīng)元(圖3A,C)。在其他臟器中，側(cè)腦室注射介導(dǎo)EGFP蛋白在肝臟和棕色脂肪組織(BAT)等臟器組織的表達(dá)量明顯低于胎盤(pán)注射的。
基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究人員選擇側(cè)腦室注射作為給藥方式進(jìn)行下步的研究。
PART
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產(chǎn)前基因治療有效緩解SMA小鼠癥狀
為了研究SMA疾病的胎兒基因治療，研究人員在小鼠胚胎時(shí)期(E14.5-E15)側(cè)腦室注射兩種rAAV基因治療載體：?jiǎn)捂渞AAV(ssAAV)和雙鏈rAAV(scAAV)載體攜帶的SMN基因(rAAV9-SMN)，并監(jiān)測(cè)了接受側(cè)腦室注射治療后小鼠的存活率及足月出生小鼠的體重和壽命(圖4A,B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未接受治療的SMA小鼠存活率最低(存活壽命不超過(guò)14天)，rAAV載體攜帶SMN基因的治療組小鼠存活壽命顯著延長(zhǎng)，但仍短于野生型健康小鼠(圖4B)。此外，接受基因治療的小鼠比SMA小鼠體重更重，且略低于健康小鼠的體重(圖4C)。
scAAV，是一個(gè)互補(bǔ)的(self-complementary)雙鏈分子，不必像傳統(tǒng)的ssAAV經(jīng)過(guò)基因組的第二鏈合成才能啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，跳過(guò)合成雙鏈這一限速步驟，直接編碼SMN蛋白，快速高效起效。
接下來(lái)，研究人員借助Western blotting和qRT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)基因治療的小鼠大腦和脊髓中的SMN蛋白得到恢復(fù)，其表達(dá)量高于野生型小鼠的，同時(shí)，scAAV攜帶的SMN基因表達(dá)量最高(圖5)。
免疫熒光結(jié)果顯示，與SMA小鼠相比，野生型小鼠和基因治療的小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中有大量的SMN表達(dá)，且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量也明顯增加(圖6A,B)。此外，scAAV9-SMN基因治療組小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及肌肉的形態(tài)也得到了改善(圖6B,C)。這提示了即使是極低水平的SMN基因表達(dá)，也足以防止肌肉萎縮。
結(jié)論
隨著胎兒基因組分析的最新進(jìn)展，醫(yī)生可以在出生前檢測(cè)出基因異常，早期發(fā)現(xiàn)可使治療計(jì)劃在產(chǎn)前或出生后不久實(shí)施。此外，基于胎兒的特殊生理特征，比如體內(nèi)的干細(xì)胞有多項(xiàng)分化潛能、胎兒體積小及其免疫系統(tǒng)尚不健全等為基因治療提供了獨(dú)特的條件，利用產(chǎn)前基因治療可以將治療基因轉(zhuǎn)染到胎兒，可使許多疾病在發(fā)病前得以治愈，這對(duì)于一些早發(fā)性遺傳性疾病可能是最佳的治療手段。目前，產(chǎn)前篩查技術(shù)的進(jìn)步和基因傳遞技術(shù)的突破為胎兒基因治療研究鋪平了道路。
在本項(xiàng)研究中，研究人員將目光聚焦產(chǎn)前基因治療，他們借助病毒載體遞送技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等手段發(fā)現(xiàn)，將rAAV9-SMN通過(guò)側(cè)腦室方式注射到胚胎期小鼠體內(nèi)，借助rAAV9病毒載體可高效地將SMN基因遞送到小鼠大腦、脊髓等部位，實(shí)現(xiàn)有效延長(zhǎng)出生后小鼠的壽命，增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量，改善肌肉萎縮現(xiàn)象。這一研究成果為胎兒基因治療SMA提供了有效的基礎(chǔ)研究支持，是胎兒基因治療取得的一個(gè)重要進(jìn)展。
