CRISPR-gRNA文庫(kù)篩選功能基因

精準(zhǔn) 高效 個(gè)性化

CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古生物菌用來(lái)抵抗外來(lái)質(zhì)?；蚴删w等遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)自從2011年被張鋒實(shí)驗(yàn)室等進(jìn)行改進(jìn)和應(yīng)用，迅速在基因編輯領(lǐng)域占據(jù)了絕對(duì)的主導(dǎo)地位?；驹硎峭ㄟ^(guò)一段與靶標(biāo)DNA相同的gRNA指導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行DNA修飾，以此造成基因的功能突變或缺失。在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立哺乳動(dòng)物全基因組突變庫(kù)或者與某類(lèi)功能相關(guān)的基因突變體庫(kù)，通過(guò)功能性篩選和富集以及隨后的PCR擴(kuò)增和深度測(cè)序分析，發(fā)掘與篩選表型相關(guān)的基因，稱(chēng)為CRISPR/Cas9 gRNA文庫(kù)篩選。gRNA文庫(kù)是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，gRNA文庫(kù)的建立將在功能基因篩選、疾病機(jī)制研究及藥物研發(fā)等方面發(fā)揮重要的功能。

九游會(huì)j9生物現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)化的GeCKO v2 human library和GeCKO v2 mouse library兩種全基因組文庫(kù)，便于全基因組范圍大規(guī)模篩選。除此，九游會(huì)j9生物還提供gRNA文庫(kù)定制服務(wù)，根據(jù)客戶(hù)的需要專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)特定信號(hào)通路的文庫(kù)，比如疾病相關(guān)通路：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：RAS信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、NF-KB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、P13K-AKT信號(hào)通路；細(xì)胞功能通路：自噬通路、細(xì)胞周期通路、凋亡通路等。另外，還可以根據(jù)客戶(hù)課題特定的信號(hào)通路定制需求，設(shè)計(jì)gRNA進(jìn)行個(gè)性化定制，客戶(hù)只需提供相關(guān)的基因名稱(chēng)即可。

CRlSPR/Cas9 gRNA文庫(kù)篩選大體流程分為五步，即gRNA文庫(kù)選擇，gRNA文庫(kù)擴(kuò)增，gRNA文庫(kù)慢病毒包裝，gRNA文庫(kù)篩?，PCR擴(kuò)增和NGS測(cè)序。

1、gRNA文庫(kù)選擇

首先客戶(hù)選擇所需gRNA文庫(kù)。如果客戶(hù)根據(jù)具體需要提出文庫(kù)定制（小于300個(gè)基因），九游會(huì)j9將根據(jù)客戶(hù)提供的基因群信息進(jìn)行單個(gè)基因的gRNA設(shè)計(jì)，保證每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)不同的gRNA，最大程度確?；蚬δ艿耐蛔?。九游會(huì)j9采用的載體是單/雙慢病毒載體，單慢病毒載體是一個(gè)載體上同時(shí)攜帶單個(gè)gRNA和cas9基因，雙慢病毒載體是一個(gè)載體上只有單個(gè)gRNA，cas9蛋白則由單獨(dú)攜帶cas9的載體提供。這兩種模式載體均攜帶有額外的抗性篩選標(biāo)記。

2、gRNA文庫(kù)擴(kuò)增

上述構(gòu)建的載體數(shù)量較少，不足以進(jìn)行文庫(kù)的慢病毒包裝和使用。因此，需要對(duì)上述載體進(jìn)行擴(kuò)增，增加總量。上述gRNA載體構(gòu)建完成后，九游會(huì)j9將這些載體按相同的比例混合成一個(gè)pool（即載體混合庫(kù)），隨后將載體混合庫(kù)使用專(zhuān)用電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)擴(kuò)增培養(yǎng)并收集菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后抽提質(zhì)粒，即得到了擴(kuò)增后的載體混合庫(kù)，也就是文庫(kù)。

3、gRNA文庫(kù)慢病毒包裝

擴(kuò)增后的gRNA文庫(kù)在慢病毒包裝載體的輔助下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝。由于gRNA文庫(kù)是由多個(gè)不同的gRNA載體混合而成，因此九游會(huì)j9獲得的慢病毒是混合型病毒庫(kù)，每個(gè)病毒攜帶單個(gè)gRNA載體。

4、gRNA文庫(kù)篩選

對(duì)篩選的目的細(xì)胞進(jìn)行病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到細(xì)胞在較低的MOI時(shí)感染百分?jǐn)?shù)，以確認(rèn)感染時(shí)gRNA文庫(kù)的病毒用量。慢病毒庫(kù)以較低的MOI值感染細(xì)胞（確保每個(gè)細(xì)胞最多進(jìn)入一個(gè)慢病毒），隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮?duì)細(xì)胞采用相應(yīng)的處理，最后經(jīng)過(guò)不同的篩選方式富集細(xì)胞。以耐藥性基因篩選實(shí)驗(yàn)為例，根據(jù)前期藥物IC50實(shí)驗(yàn)，得到藥物篩選實(shí)驗(yàn)的處理濃度。采用高濃度藥物處理感染后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選后存活的細(xì)胞則具有一定的耐藥性，將此群細(xì)胞擴(kuò)增并收集下來(lái)，耐藥性的來(lái)源是CRlSPR/Cas9 gRNA對(duì)相應(yīng)基因的修飾。

5、PCR擴(kuò)增和NGS測(cè)序

對(duì)步驟4篩選中富集下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體的PCR擴(kuò)增，該擴(kuò)增片段包含載體所攜帶的gRNA序列，通過(guò)后續(xù)的NGS測(cè)序，九游會(huì)j9可以得到富集細(xì)胞中gRNA的富集度，從而尋找到相應(yīng)的基因，這些基因很有可能參與藥物作用過(guò)程，因此可作為深入研究的待選基因。

實(shí)驗(yàn)流程如下：

gRNA文庫(kù)類(lèi)型：

1、 全基因組gRNA文庫(kù)，可以敲除19050個(gè)表達(dá)基因和1864個(gè)miRNA：

1) 敲除文庫(kù)，human，慢病毒單病毒，19,050 genes 1,864 miRNAs；

2) 敲除文庫(kù)，mouse，慢病毒單病毒，20,611 genes 1,175 miRNAs；

3) 敲除文庫(kù)，human，慢病毒雙病毒，1,880 unknown function genes。

2、 定制gRNA文庫(kù)，可根據(jù)通路中特定基因設(shè)計(jì)gRNA：

1)   疾病相關(guān)基因：抑癌基因、原癌基因、糖尿病基因、心血管疾病基因、帕金森病基因等；

2)   信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：RAS信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等；

3)   細(xì)胞功能相關(guān)：自噬、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、血管新生、腫瘤抑制等。

gRNA文庫(kù)篩選表型：

1)   腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因篩。ㄌ迥諫稈。

2)   細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。

3)   細(xì)胞克隆形成相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。

4)   細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。

5)   腫瘤耐藥相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。

6)   細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)基因篩。ㄌ逋饃稈。

7)   其他功能基因篩選，如自噬、細(xì)胞分化等

gRNA文庫(kù)應(yīng)用領(lǐng)域：

1) 探索藥物作用機(jī)制：藥物靶點(diǎn)確定與驗(yàn)證

2) 尋找腫瘤治療靶點(diǎn)：基因環(huán)路上下游調(diào)控機(jī)制分析

3) 探究代謝疾病治療機(jī)制：代謝通路調(diào)節(jié)機(jī)制分析

九游會(huì)j9的優(yōu)勢(shì)：

1)   產(chǎn)品全面：不僅擁有人類(lèi)和小鼠的全基因組gRNA現(xiàn)貨文庫(kù)，而且可以定制任何類(lèi)型的特定文庫(kù)，后期更有活性文庫(kù)即將推出！

2)   價(jià)格劃算：現(xiàn)在訂購(gòu)gRNA文庫(kù)享有一定折扣優(yōu)惠，讓您的實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)、快速和高效地進(jìn)行。

3)   種類(lèi)多樣：九游會(huì)j9不僅可以使用單克隆形式構(gòu)建sgRNA載體，也可以使用芯片形式合成，確保最大的覆蓋率。

4)   服務(wù)到位：九游會(huì)j9除了可以提供gRNA文庫(kù)質(zhì)：筒《疽醞猓箍梢園錟邢亂徊降納稈。鈧仗峁┠勘昊蠣。