糖尿病是全球?qū)θ祟惤】涤泻Φ那易铍y根治的代謝疾病之一。最近的研究表明, 由胰島巨噬細(xì)胞重編程引起的慢性炎癥顯著促進(jìn)了肥胖向Ⅱ型糖尿病的轉(zhuǎn)化。重編程的胰島巨噬細(xì)胞不僅破壞了胰島素的分泌能力, 而且導(dǎo)致β細(xì)胞增生和變性。盡管已經(jīng)有研究表明, 胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞的增殖可能受到細(xì)胞間接觸和β細(xì)胞釋放的ATP調(diào)節(jié), 但在脂肪酸或葡萄糖水平升高的情況下, 胰島衍生的特異性局部信號傳導(dǎo)和胰島內(nèi)巨噬細(xì)胞重編程的確切機(jī)制仍不清楚。

G蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）是一個(gè)“和G蛋白連接才能工作的受體”, 它通常位于細(xì)胞膜上并且參與大部分生理功能的調(diào)節(jié)。肥胖和糖尿病的發(fā)生經(jīng)常伴隨著脂質(zhì)過氧化物的增加, 脂質(zhì)過氧化物通？梢約せ頖PCR發(fā)揮作用。有研究表明胰島內(nèi)源性脂肪酸通過激活GPR120可以調(diào)控胰島δ細(xì)胞-β細(xì)胞環(huán)路從而激活下游信號通路。GPR132是GPCRs的一種, 可識別溶血磷脂酰膽堿, 環(huán)氧二十碳三烯酸和9(S)-HODE, 然而GPR132在胰島巨噬細(xì)胞中扮演的角色仍未得到深入研究。

2023年9月, 山東大學(xué)于曉團(tuán)隊(duì)，北京大學(xué)孫金鵬團(tuán)隊(duì)聯(lián)合焦寧團(tuán)隊(duì)通過冷凍電鏡對GPR132-鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(Gi)與其配體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析, 發(fā)現(xiàn)了GPR132與其配體識別和激活的結(jié)構(gòu)機(jī)制，而且開發(fā)了GPR132定向選擇性激動(dòng)劑NOX-6-1。此外，研究團(tuán)隊(duì)通過將弱激動(dòng)劑NOX-6-1中酰胺連接改為磺酰胺連接，發(fā)現(xiàn)其不僅消除了Gi的活性，并拮抗了內(nèi)源性配體激活Gi活性。研究團(tuán)隊(duì)采用分子動(dòng)力學(xué)模擬、FlAsH-BRET和生化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法來評估化合物的結(jié)合位置，發(fā)現(xiàn)了GPR132拮抗劑與激動(dòng)劑之間轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強(qiáng)效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）。通過研究發(fā)現(xiàn)NOX-6-18能夠調(diào)節(jié)胰島巨噬細(xì)胞重編，減少體重增加，促進(jìn)葡萄糖代謝。

 

1.GPR132參與胰島巨噬細(xì)胞重編程

首先, 研究者發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠的胰島巨噬細(xì)胞中的炎癥因子顯著上調(diào), 并且用有機(jī)溶劑裂解提取的胰島巨噬細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)水平顯著高于甲醇溶解提取的部分, 說明這些炎癥因子與脂質(zhì)代謝有關(guān), 通過質(zhì)譜分析, 研究者發(fā)現(xiàn)9(S)-HODE，二十二碳六烯酸和花生四烯酸水平在高脂飲食小鼠的胰島組織中顯著升高。然而, 只有9(S)-HODE能夠促進(jìn)胰島巨噬細(xì)胞中的炎癥因子的表達(dá), 并且促進(jìn)巨噬細(xì)胞增值, 與此同時(shí), 9(S)-HODE的增加會(huì)導(dǎo)致GPR132的高表達(dá)。而胰島巨噬細(xì)胞特異性敲除GPR132會(huì)逆轉(zhuǎn)9(S)-HODE誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。這些結(jié)果表明GPR132在內(nèi)源性脂質(zhì)刺激或高脂飲食壓力下會(huì)發(fā)生巨噬細(xì)胞重編程。


 

圖1 胰島巨噬細(xì)胞重編程過程中GPR132信號通路的上調(diào)

2.GPR132-Gi信號有助于胰島巨噬細(xì)胞的重編程

為了進(jìn)一步研究GPR132-Gi與巨噬細(xì)胞重編程的關(guān)系, 用9(S)-HODE處理胰島巨噬細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)胰島巨噬細(xì)胞中的吞噬能力增加, 炎癥因子Il1b, Tnf, Ccl2和Cxcl1 mRNA水平顯著升高。然而經(jīng)Gi抑制劑百日咳毒素 (PTX) 預(yù)處理后，由9(S)-HODE引起的胰島巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯降低。同樣, 使用Cre品系動(dòng)物+DIO病毒 (pADV-mCMV-DIO-pertussis toxin subunit 1 (TOX1)-P2A-EGFP) 在胰腺巨噬細(xì)胞過表達(dá)PTX也出現(xiàn)了同樣的效果。這些結(jié)果表明GPR132在胰島巨噬細(xì)胞中介導(dǎo)的功能參與了9(S)-HODE誘導(dǎo)的胰島炎癥反應(yīng)和胰島巨噬細(xì)胞重編程。

圖2 GPR132- Gi信號有助于胰島巨噬細(xì)胞重編程和GPR132復(fù)合物樣品制備

3.冷凍電鏡對apo-GPR132–Gi1, NPGLY–GPR132–Gi1和9(S)-HODE–GPR132–Gi1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析
研究團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡解析了NPGLY-GPR132-Gi和9(S)-HODE–GPR132–Gi1的結(jié)構(gòu),通過分析發(fā)現(xiàn)，兩種內(nèi)源性配體通過兩個(gè)不同的口袋與GPR132受體結(jié)合, NPGLY占據(jù)配體結(jié)合口袋左側(cè)使口袋呈“L”形, 而9(S)-HODE具有更深的配體結(jié)合位置。雖然兩種配體具有不同的結(jié)合口袋, 但是兩種激動(dòng)劑9(S)-HODE和NPGLY具有相似的激活機(jī)制, 都是通過與GPR132的Y127^3.37和Y200^5.39發(fā)生直接交互作用。此外，用丙氨酸殘基替換GPR132的F208^5.47, Y258^6.51和H259^6.52殘基會(huì)損害GPR132對NPGLY或9(S)-HODE的激活作用, 說明由Y258^6.51-F208^5.47-H259^6.32-F255^6.48組成的疏水鏈的構(gòu)象重排是內(nèi)源性激動(dòng)劑激活GPR132的共同機(jī)制。這些結(jié)果表明GPR132配體口袋的可塑性以及對NPGLY或9(S)-HODE結(jié)合和激活至關(guān)重要的關(guān)鍵殘基的識別可能有助于合理設(shè)計(jì)選擇性GPR132激動(dòng)劑或拮抗劑。

圖3 GPR132–Gi的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
 

圖4 GPR132的組成活性以及NPGLY和9(S)-HODE對GPR132的結(jié)合和激活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

4.基于GPR132結(jié)構(gòu)的分子化合物的篩選

GPR132的選擇性激動(dòng)劑有助于及時(shí)識別GPR132在特定生理過程中所起的精確作用，并且可以通過對激動(dòng)劑的修飾衍生出GPR132的拮抗劑。因此，研究者進(jìn)行了計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選, 以確定調(diào)節(jié)GPR132的潛在的活性候選化合物。通過SiteMap算法, 以及分子動(dòng)力學(xué)模擬，分別計(jì)算了兩個(gè)“正構(gòu)位點(diǎn)”殘基的能量貢獻(xiàn), 并結(jié)合突變驗(yàn)證，確定了配體設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)殘基。另外, 研究者通過NOX多樣性小分子化合物庫，發(fā)現(xiàn)苗頭化合物NOX-6-1（EC50約為1124nM）。通過藥物設(shè)計(jì), 藥物化學(xué)合成以及藥理學(xué)表征，最終成功地發(fā)現(xiàn)了GPR132選擇性激動(dòng)劑NOX-6-7（EC50約為30nM）。接下來，研究者將NOX-6-7注入了小鼠胰島巨噬細(xì)胞中, 發(fā)現(xiàn)它能夠誘導(dǎo)胰島巨噬細(xì)胞重編程，并增加胰島巨噬細(xì)胞的吞噬能力。然而, 這些作用會(huì)被Gi抑制劑-PTX消除。這些結(jié)果表明，NOX-6-7是評估GPR132下游Gi信號功能的有用分子，GPR132中的Gi信號在胰島穩(wěn)態(tài)中起重要作用。
 

圖5 基于Gi基礎(chǔ)的GPR132激動(dòng)劑開發(fā)

5.GPR132拮抗劑的篩選-NOX-6-18

此外，研究團(tuán)隊(duì)通過將弱激動(dòng)劑NOX-6-1中酰胺連接改為磺酰胺連接，發(fā)現(xiàn)其不僅消除了Gi的活性，并拮抗了內(nèi)源性配體激活Gi活性。研究團(tuán)隊(duì)采用分子動(dòng)力學(xué)模擬, FlAsH-BRET和生化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法來評估化合物的結(jié)合位置, 發(fā)現(xiàn)了GPR132拮抗劑與激動(dòng)劑之間轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強(qiáng)效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）。接下來，九游會(huì)j9進(jìn)行了計(jì)算模擬，以了解NOX-6-18如何與GPR132相互作用。在最終的模型中，插入口袋1中的NOX-6-18的羧酸頭與GPR132的R203^5.42發(fā)生電荷基相互作用。另外, NOX-6-18的4-氧-4-苯基丁胺與GPR132的TM3, ECL2, TM5-7的疏水殘基以及與Y258^6.51和K265^6.58的氫鍵形成廣泛的疏水接觸。并且，研究結(jié)果表明NOX-6-18與GPR132中TM5-TM7特異性殘基之間的相互作用是NOX-6-18對GPR132選擇性的決定因素。
 

圖6 選擇性GPR132拮抗劑的研制

6.NOX-6-18對高脂飲食小鼠糖代謝的影響

接下來，為了確定合成的GPR132拮抗劑是否在體內(nèi)產(chǎn)生有益的代謝作用。研究者在高脂飲食誘導(dǎo)的雄性和雌性小鼠中，給予NOX-6-18治療12-14周，發(fā)現(xiàn)NOX-6-18能夠改善高脂飲食引起的體重增加, 此外，高脂飲食小鼠的葡萄糖耐量和胰島素耐量得到顯著改善。另外, 在NOX-6-18治療4-6周后, NOX-6-18顯著降低了胰島, 肝臟和脂肪組織的炎癥水平，并且減少了胰島組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)量, 進(jìn)而改善了代謝紊亂。這些結(jié)果表明，在飼喂高脂飲食的小鼠中，給予拮抗劑NOX-6-18能夠顯著增強(qiáng)胰島巨噬細(xì)胞的葡萄糖代謝，并以GPR132依賴的方式降低其增殖速率和重編程程度。

圖7 GPR132拮抗劑改善高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的葡萄糖代謝

文章結(jié)論與展望

總的來說, 作者通過代謝組學(xué)結(jié)合分子學(xué)實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)了9(S)-HODE的水平以及GPR132的表達(dá)水平與糖尿病呈正相關(guān), 通過反向驗(yàn)證 (基因敲除), 發(fā)現(xiàn)GPR132在內(nèi)源性脂質(zhì)刺激或高脂飲食壓力下會(huì)發(fā)生巨噬細(xì)胞重編程。另外通過冷凍電鏡, 分子動(dòng)力學(xué)模擬, FlAsH-BRET以及化合物篩選發(fā)現(xiàn)了GPR132拮抗劑與激動(dòng)劑之間轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強(qiáng)效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）, 其在改善糖尿病的進(jìn)程中發(fā)揮了顯著的作用, 為糖尿病的臨床治療提供了一個(gè)可靠的治療途徑。

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