時間：2023-05-31 熱度：

氟化物是一種公認的環(huán)境污染物，在全球范圍內(nèi)廣泛存在，我國長期存在飲水型、燃煤型及飲茶型等不同類型的高氟暴露現(xiàn)象，是遭受氟威脅最嚴重、地區(qū)分布最廣泛的國家之一。雖然適量的氟對機體牙齒、骨骼的鈣化、神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)和酶系統(tǒng)的代謝均有促進作用，但大量的研究表明高氟暴露可嚴重：褰】，包括誘發(fā)氟中毒，氟骨病等，還會對腎臟、肝臟、心血管、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織均有不同程度的損害作用。值得注意的是，氟化物引起的腦損傷導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的報道先于牙齒病變，研究發(fā)現(xiàn)，氟化物暴露可損害神經(jīng)中樞并誘導(dǎo)記憶功能障礙，且腦功能損傷及其潛在機制可能因氟化物劑量而異。然而氟化物誘發(fā)腦功能障礙的機制仍不明確。

研究成果

2023年5月7日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院倪學(xué)勤教授團隊在國際環(huán)境領(lǐng)域知名期刊《Journal of Hazardous Materials》上發(fā)表題為“Prolonged Fluoride Exposure Induces Spatial-memory Deficit and Hippocampal Dysfunction by Inhibiting Small Heat Shock Protein 22 in Mice”的研究論文。該研究揭示了長期高氟飲水可導(dǎo)致小鼠線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能的蛋白Hsp22通過介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個關(guān)鍵信號通路參與高氟所致空間記憶損傷的重要潛在機制。該成果進一步提示了長期生活于高氟暴露地區(qū)人民的潛在健康隱患。

 

結(jié)果

01  長期接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶缺陷及認知功能障礙

首先，研究團隊構(gòu)建氟暴露小鼠模型：4周齡小鼠給予含25ppm（低劑量組）或50ppm（高劑量組）NaF的含氟飲用水，持續(xù)56周至老年期（圖1A）。借助Morris水迷宮試驗（Morris water maze, MWM）探討了慢性氟化物暴露對認知功能的影響，定位航行實驗和空間探索實驗結(jié)果顯示，氟暴露組小鼠的逃避潛伏期顯著增加，在有效區(qū)域（原平臺所在區(qū)域）穿梭停留時間明顯降低，提示了長期接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶缺陷，認知學(xué)習(xí)能力下降，且損傷程度與氟暴露之間存在劑量依賴關(guān)系（圖1）。

 

圖1 長時間接觸氟化物導(dǎo)致小鼠空間記憶障礙

 

為研究氟暴露是否會在短期內(nèi)導(dǎo)致小鼠記憶缺陷，研究者分別給予8周齡和48周齡小鼠含氟（50ppm）飲用水，連續(xù)12周（圖2A,B）。MWM結(jié)果顯示，短期氟暴露組小鼠穿越原平臺次數(shù)及逃避潛伏期和對照組小鼠相比無明顯區(qū)別（圖2C,D），神經(jīng)元功能維持至關(guān)重要的功能基因BDNF和CREB蛋白表達水平也無明顯變化（圖2E,F）。這些結(jié)果提示了氟化物暴露在短期內(nèi)不會引起記憶缺陷，引起高氟所致空間記憶損傷取決于長期暴露。

 

圖2 短期氟化物暴露不會引起小鼠記憶缺陷

 

02 長期氟暴露誘導(dǎo)小鼠海馬損傷及線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙

接下來，研究團隊探究長時間氟暴露對小鼠海馬的影響，發(fā)現(xiàn)氟暴露組小鼠的體重、腦重，以及高劑量氟暴露組（F-High）小鼠的腦體指數(shù)均明顯低于對照組小鼠（圖3A），氟暴露引起的病理改變主要在海馬CA3和CA1區(qū)，表現(xiàn)為神經(jīng)元變性顯著增加，F(xiàn)-High組小鼠神經(jīng)元數(shù)量明顯降低（圖3D）。氟暴露組小鼠海馬中BDNF和CREB的mRNA和蛋白水平顯著下降（圖3B,C,E）。這些結(jié)果提示了長期接觸氟化物誘導(dǎo)海馬損傷。

 

圖3 長期氟暴露誘導(dǎo)海馬損傷和記憶相關(guān)蛋白下調(diào)

 

隨后，研究團隊進一步探究了氟暴露對海馬神經(jīng)振蕩和神經(jīng)元動作電位發(fā)放的影響。通過對小鼠海馬CA1神經(jīng)元進行細胞外記錄，發(fā)現(xiàn)氟暴露誘發(fā)局部場電位（local field potential, LFP）光譜功率變化，LFP顯著降低，同時theta, alpha, beta和gamma頻段振蕩下降（圖4B）。此外，氟暴露組小鼠的海馬神經(jīng)元放電明顯降低，誘導(dǎo)LTP的能力受損（圖4C,D）。以上結(jié)果均呈劑量依賴性（圖4）。

 

圖4 長期氟暴露改變了海馬神經(jīng)元放電

 

透射電鏡（TEM）觀察發(fā)現(xiàn)，氟暴露組小鼠海馬線粒體結(jié)構(gòu)異常，神經(jīng)元凋亡（圖5A），線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）和ATP含量呈劑量依賴性下降（圖5B,C）。通過對海馬線粒體呼吸鏈復(fù)合體分析發(fā)現(xiàn)，氟暴露導(dǎo)致線粒體生物發(fā)生受到抑制，呼吸鏈復(fù)合體I/II/III/V活性明顯降低（圖5D-G）。

 

圖5 長期氟暴露誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元線粒體功能障礙

 

03  長期氟暴露抑制Hsp22的表達及其介導(dǎo)的PGC-1α/ TFAM和NF-κβ/STAT3信號通路

基于上述結(jié)果，研究團隊進一步探討了介導(dǎo)這些影響的潛在調(diào)節(jié)因子。借助分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，長時間氟暴露組小鼠中Hsp22和ATF4的表達顯著降低（圖6A,B）。Hsp22缺失和ATF4高表達抑制了線粒體功能，Hsp22可通過PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3這兩個關(guān)鍵信號通路介導(dǎo)線粒體功能。PGC-1α-TFAM信號通路促進線粒體生物發(fā)生，NF-κβ-STAT3信號通路提高線粒體呼吸鏈酶的活性。鑒于此，作者研究這兩條信號通路發(fā)現(xiàn)，氟暴露導(dǎo)致PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路被抑制，PGC-1α蛋白水平降低，高劑量氟暴露組TFAM蛋白水平亦顯著降低（圖6C-E）。此外，細胞和線粒體中STAT3的蛋白水平各組間無顯著差異，線粒體中p-S727 STAT3（被Hsp22激活并易位到線粒體的效應(yīng)蛋白）表達水平呈氟暴露劑量依賴性降低（圖6E,F）。

 

圖6 長期氟暴露抑制海馬Hsp22的表達及其介導(dǎo)的線粒體調(diào)控通路

04  Hsp22通過介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路雙向調(diào)控長期氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷

為探究Hsp22是否參與氟暴露誘導(dǎo)的小鼠記憶缺陷，研究者在小鼠海馬區(qū)注射pAAV-hSyn-EGFP-P2A-Hspb8–3xFLAG-WPRE病毒，以特異性在海馬神經(jīng)元中過表達Hsp22（圖7A-C）。MWM結(jié)果顯示，過表達Hsp22（F + pAAV-Hsp22）可顯著逆轉(zhuǎn)由氟化物暴露引起的逃避潛伏期增加和穿越原平臺次數(shù)減少的現(xiàn)象（圖7D,E）。這提示了Hsp22過表達改善了長時間氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷。

 

圖7 海馬神經(jīng)元過表達Hsp22可改善長期氟暴露引起的記憶缺陷

 

進一步研究發(fā)現(xiàn)，Hsp22過表達改善氟暴露引起的突觸可塑性損傷（圖8A-C），以及逆轉(zhuǎn)了線粒體生物發(fā)生受到抑制的情況，恢復(fù)線粒體呼吸鏈復(fù)合體I/II/V活性，促進ATP水平升高，改善線粒體功能障礙（圖8D-E）。

 

圖8 海馬神經(jīng)元過表達Hsp22通過介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)長期氟暴露誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

 

最后，研究者在小鼠海馬區(qū)下調(diào)Hsp22的表達進一步驗證其在氟化物誘導(dǎo)記憶缺陷中的作用，將pAAV-U6-shRNA(Hspb8)-CMV-EGFP-WPRE注射小鼠海馬以下調(diào)Hsp22的表達（圖9A-C）。MWM結(jié)果顯示，氟暴露組小鼠海馬下調(diào)Hsp22表達（F+Hsp22 shRNA）后，加重了小鼠空間記憶損傷，表現(xiàn)為更明顯延長的逃避潛伏期（圖9D-E）。

 

圖9 Hsp22缺失加重了長期氟暴露誘發(fā)的記憶缺陷

 

借助分子生物學(xué)技術(shù)和電生理記錄顯示，Hsp22缺失對正常小鼠線粒體功能沒有影響，但加重了氟暴露誘發(fā)的海馬突觸可塑性損傷及線粒體生物發(fā)生（圖10）。

 

綜上，這些數(shù)據(jù)提示了海馬神經(jīng)元中Hsp22參與氟暴露誘導(dǎo)的小鼠記憶缺陷機制，其通過介導(dǎo)PGC-1α-TFAM和NF-κβ-STAT3信號通路雙向調(diào)控長期氟暴露誘發(fā)的空間記憶缺陷，海馬神經(jīng)元中高表達Hsp22可通過激活信號通路促進線粒體生物發(fā)生和線粒體呼吸復(fù)合物活性的增強改善氟化物所致的空間記憶缺陷；而下調(diào)Hsp22的表達通過抑制線粒體功能加劇高氟導(dǎo)致的認知能力下降。

 

圖10 Hsp22缺失加劇了長期氟暴露誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

 

結(jié)論

本文借助分子生物學(xué)技術(shù)、行為學(xué)范式、病毒載體介導(dǎo)的基因功能獲得/丟失、電生理記錄等手段揭示了長期氟暴露對小鼠空間記憶的影響及其機制。研究發(fā)現(xiàn)，長期低劑量高氟飲水可致小鼠空間記憶障礙，海馬線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，且調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)和功能的蛋白Hsp22表達受到抑制。通過AAV介導(dǎo)的活體特異性調(diào)控海馬Hsp22表達，證實Hsp22下調(diào)介導(dǎo)的PGC-1α/ TFAM-mtDNA信號軸以及NF-κβ/STAT3-線粒體酶活性信號軸的抑制是氟所致空間記憶損傷的重要潛在機制。該成果為長期氟暴露導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了理論支持，并進一步揭示了長期生活于高氟暴露地區(qū)人民的潛在健康隱患。

 

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院博士辛金鴿為論文第一作者，倪學(xué)勤教授為通訊作者。電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院徐鵬教授為論文共同通訊作者。本研究得到了國家自然科學(xué)基金及四川省自然科學(xué)基金的支持。

九游會j9生物有幸為研究者提供實驗中使用的全部AAV載體，以實際行動助力神經(jīng)科學(xué)研究！

 

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389423008786