時間：2022-11-16 熱度：

?就要做慢病毒實驗了，卻無從下手？
實驗前都要做哪些準(zhǔn)備呢？
什么是MOI？選個什么樣的細(xì)胞呀？怎樣提高病毒感染效率？
為什么慢病毒感染后細(xì)胞狀態(tài)變差？熒光不亮又是怎么回事呢？
 ……

知己知彼才能戰(zhàn)勝九游會j9遇到的問題，跟隨小編來了解一下今天的主角——慢病毒。

 

九游會j9生物●慢病毒的安全性
 

九游會j9生物提供慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎(chǔ)經(jīng)過人工構(gòu)建的重組慢病毒，不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒再去感染其他細(xì)胞，且病毒中的毒性基因已被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。操作上相對安全，但在使用過程中仍需要遵守安全使用規(guī)范：

• 實驗前：規(guī)范穿著及佩戴實驗服、手套、口罩和帽子；

• 實驗中：在BSL-2實驗室的生物安全柜中操作，避免對病毒進(jìn)行操作時產(chǎn)生飛濺；

• 實驗后：接觸過病毒的耗材需加入84消毒液（10:1）浸泡24h后處理，相關(guān)的廢棄物需要收集統(tǒng)一滅菌，用肥皂清洗雙手；

※若不小心接觸到皮膚，別慌！請立即用大量水沖洗5min，皮膚裸露處可使用酒精噴一下，如有不適請及時就醫(yī)。

 

九游會j9生物●慢病毒的包裝及侵染細(xì)胞的機(jī)制

九游會j9生物的慢病毒包裝采用三質(zhì)粒或是四質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行包裝，將包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒以及穿梭質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，通過細(xì)胞的培養(yǎng)上清液純化病毒。慢病毒通過膜融合或內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞釋放RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶等的作用形成DNA整合前復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核并隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨后開始轉(zhuǎn)錄翻譯(如圖1)。
 

貼心tips：如何提高病毒滴度？

1. 293T細(xì)胞處于對數(shù)生長期；

2. 質(zhì)粒濃度大于1mg/mL，且無蛋白、核酸等污染；

3. 于轉(zhuǎn)染后48h和72h兩次收毒，提高病毒的量；

4. 九游會j9生物針對編碼基因，非編碼基因?qū)е碌某龆井惓?，專門開發(fā)了已授權(quán)的專利——Vpack慢病毒包裝系統(tǒng)，解決病毒不出毒, 滴度低的問題。

 

九游會j9生物●慢病毒的滴度檢測

滴度：即單位體積中有感染能力的病毒數(shù)目，單位TU/mL，是活性滴度單位，主要是指能夠感染并進(jìn)入細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)量。

常用的滴度檢測方法有：

1. 通過酶聯(lián)免疫吸附測定法對病毒顆粒中的P24蛋白進(jìn)行檢測；

2. 定量PCR對病毒顆粒的RNA拷貝數(shù)進(jìn)行檢測；

（1和2兩種快速檢測方法未考慮到病毒活性，因此是不準(zhǔn)確的）

3. 定量PCR對整合到基因組DNA中的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，可以準(zhǔn)確知道轉(zhuǎn)到細(xì)胞的病毒顆粒濃度（九游會j9生物病毒滴度的檢測方法）

 

九游會j9生物●提高慢病毒的感染效率

1. 保證細(xì)胞狀態(tài)良好，正常增殖，輪廓清晰；

2. 確定合適的MOI：可查閱文獻(xiàn)，獲得目標(biāo)細(xì)胞參考MOI，或進(jìn)行MOI梯度摸索預(yù)實驗，設(shè)置0/10/20/40/80不同的MOI梯度，在72h后選取感染效率達(dá)到80%左右且細(xì)胞狀態(tài)良好的最小MOI值（較低的MOI可以避免細(xì)胞毒性的產(chǎn)生）；

3. 選擇助轉(zhuǎn)劑polybrene，是一種陽離子聚合物，可中和界面電荷促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜結(jié)合，有效提高10-30%的感染效率；

4. 若是感染懸浮細(xì)胞，減少病毒感染時的體積，可提高感染效率。將細(xì)胞培板用封口膜密封，水平轉(zhuǎn)子低速離心（＜1200g）1h，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

5. 若是極難感染的細(xì)胞可采用重復(fù)感染增加感染效率（注意重復(fù)感染間細(xì)胞的狀態(tài)）。

※病毒量計算方法：病毒加樣量（μL）=（細(xì)胞數(shù)×MOI/病毒原液滴度）×10³

 

九游會j9生物●慢病毒的使用與保存

慢病毒通常采用干冰運(yùn)輸，若在收到貨后3d內(nèi)使用完，病毒可在4℃短期保存，若長期保存需置于-80℃保存。注意稀釋病毒前，病毒需在冰上融化，用PBS或是培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)的濃度，且避免反復(fù)凍融降低病毒活性，可進(jìn)行適當(dāng)體積的分裝。

 

當(dāng)你在做慢病毒實驗時，可能會遇到很多問題，但有很多共性問題是大部分科研人都會遇到的，小編今天就總結(jié)了一些經(jīng)常遇到的問題以及解決辦法，一起來看看吧。

九游會j9生物●慢病毒常見問題

01  什么是MOI？

答：MOI，感染復(fù)數(shù)，定義為感染時病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值，即平均每個細(xì)胞感染的病毒活性單位數(shù)。也會反映出病毒對細(xì)胞的感染能力，MOI越高，細(xì)胞越難被感染。在實驗中細(xì)胞感染率達(dá)到80%的MOI定義為這種細(xì)胞的最適MOI。

 

02  慢病毒感染細(xì)胞后，目的基因或干擾序列的表達(dá)是瞬時表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)？

答：因為慢病毒具有整合外源序列至宿主基因組中的能力，因此外源序列是穩(wěn)定表達(dá)，并隨細(xì)胞的增殖分化一起復(fù)制并遺傳到子細(xì)胞中。

 

03  慢病毒載體可以作為常規(guī)的過表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行使用嗎？

答：可以，但慢病毒載體骨架較大，整個質(zhì)粒較普通真核載體大，會影響轉(zhuǎn)染效率。

 

04  病毒感染細(xì)胞后為何狀態(tài)會變差？

答：

1. 病毒感染換液時間不宜超過24h；

2. 外源表達(dá)基因與生命活動有關(guān)，影響細(xì)胞狀態(tài)；

3. 敏感細(xì)胞，MOI過高會對細(xì)胞造成傷害。

 

05  過表達(dá)質(zhì)粒/病毒，為什么目的抗體檢測會出現(xiàn)兩條帶？

答：

1. 標(biāo)簽具有一定大。庠幢澩锏牡鞍滓饒讜吹鞍狀笠恍

2. 外源表達(dá)的蛋白與內(nèi)源蛋白表達(dá)后的修飾有所差異，導(dǎo)致蛋白條帶大小不一致；

3. 目的抗體特異性較差，檢測到不同的異構(gòu)體?？蓢L試標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測。

 

06  慢病毒感染細(xì)胞后基因表達(dá)何時達(dá)到峰值？

答：一般的細(xì)胞在慢病毒感染72h左右GFP或外源序列的表達(dá)會達(dá)到峰值，生長緩慢的細(xì)胞達(dá)到峰值的時間會延長。

 

07  過表達(dá)病毒感染后，為什么目的抗體檢測不到過表達(dá)效果？

答：在保證慢病毒感染效率的條件下，可能存在以下原因：

1. 細(xì)胞目的基因內(nèi)源表達(dá)水平太高會影響外源基因的表達(dá)，可通過qPCR檢測本底表達(dá)，選擇低表達(dá)的細(xì)胞系；

2. 目的基因與細(xì)胞生長增殖等相關(guān)性較高，過表達(dá)會影響細(xì)胞狀態(tài)、生長、增殖等，細(xì)胞自身調(diào)控作用會抑制目的基因的過表達(dá)效果；

3. 目的抗體靈敏度或特異性不夠，可嘗試標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均為外源過表達(dá)的蛋白。

 

08  干擾慢病毒感染后，為什么目的抗體檢測不到干擾效果？

答：在保證慢病毒感染效率的條件下，可能存在以下原因：

1. 細(xì)胞目的基因內(nèi)源表達(dá)水平太低，很難通過敲減手段使其表達(dá)更低，可通過qPCR檢測本底表達(dá)，選擇高表達(dá)的細(xì)胞系；

2. 目的基因與細(xì)胞生長增殖等相關(guān)性較高，敲減會影響細(xì)胞狀態(tài)、生長、增殖等，細(xì)胞自身調(diào)控作用會抑制目的基因的敲減效果；

3. 體內(nèi)敲減在取材時無法保證只取特異性組織或細(xì)胞進(jìn)行干擾檢測，可用原位雜交或是免疫熒光等方式檢測；

4. 目的抗體靈敏度或特異性不夠，可嘗試用qPCR的方法檢測。

 

09  干擾慢病毒感染細(xì)胞的MOI是否可直接應(yīng)用于過表達(dá)慢病毒實驗？

答：針對同一家公司的病毒，可以參考原來的MOI值，敏感細(xì)胞可考慮在原MOI值的基礎(chǔ)上，上下選擇1-2個梯度進(jìn)行MOI摸索；若是不同公司的病毒建議重新進(jìn)行MOI梯度摸索預(yù)實驗。

 

10  為什么慢病毒感染后的熒光較弱？

答：熒光蛋白的表達(dá)與啟動子、表達(dá)方式、連接元件等有關(guān)

1. 如CMV等強(qiáng)啟動子會使熒光表達(dá)較強(qiáng)；

2. 融合表達(dá)可能會導(dǎo)致熒光蛋白的錯誤折疊造成檢測不到熒光信號或信號較弱；

3. 當(dāng)過表達(dá)基因在熒光蛋白上游時，過表達(dá)的基因片段過長或高GC片段會降低下游熒光蛋白的強(qiáng)度，較對照組的熒光弱；

4. 非融合表達(dá)時IRES連接元件下游熒光蛋白明顯弱于上游的目的基因的表達(dá)。

 

11  慢病毒感染細(xì)胞后2-3周，為什么熒光或過表達(dá)（干擾）效果沒有開始感染時好？

答：隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制會使外源序列表達(dá)趨于穩(wěn)定，因此，較感染最初的瞬時效果可能會出現(xiàn)熒光或過表達(dá)（干擾）效果減弱的現(xiàn)象。

 

12  是否可以在同一穩(wěn)定株中同時過表達(dá)或干擾兩個基因？

答：可以，細(xì)胞可承受條件下，可將兩個基因（靶點(diǎn)）構(gòu)建到同一載體上或分別構(gòu)建到兩個載體上，并且兩個載體的真核抗性不同。

……

 

沒有找到你遇到的問題的解決辦法？沒關(guān)系，更多問題可在留言板中留言或是后臺聯(lián)系小編與你一起解決。也歡迎大家踴躍留下在使用慢病毒時困擾著你的問題。

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