行為靈活性（Behavioral flexibility）是一種根據(jù)不斷變化的環(huán)境或突發(fā)事件作出調(diào)整的重要能力，在多數(shù)神經(jīng)精神類疾病如自閉癥、精神分裂癥、強(qiáng)迫癥和遲發(fā)性癡呆等疾病中存在，且在衰老過程中也會伴隨著靈活性和認(rèn)知缺陷。然而，衰老過程中行為靈活性受損的潛在機(jī)制尚不清楚。

近日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系朱玲強(qiáng)教授團(tuán)隊在Molecular Psychiatry雜志發(fā)表研究論文“Social isolation reinforces aging-related behavioral inflexibility by promoting neuronal necroptosis in basolateral amygdala”。研究借助快速老化SAMP8小鼠模型，首次揭示老年行為靈活性障礙的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)糖原合酶激酶-3（GSK-3α）調(diào)控mTORC1信號通路參與基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala, BLA）神經(jīng)元程序性壞死及行為靈活性障礙。同時研究還揭示了目前老年人中普遍存在的生活方式—獨(dú)居是老年行為靈活性障礙的高危因素，并提出了可能的干預(yù)策略。
 

結(jié)果

衰老小鼠BLA神經(jīng)元活性降低，表現(xiàn)行為靈活性障礙
 

首先，研究者借助基于氣味刺激的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)行為學(xué)范式測試5月齡快速老化SAMP8小鼠的行為靈活性：小鼠選擇氣味1時給予食物獎賞，選擇氣味2時無獎賞，待小鼠的正確選擇達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)測試，小鼠選擇氣味1時無獎賞，選擇氣味2時給予獎賞（圖1A,B），結(jié)果顯示，5月齡SAMP8小鼠在反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)過程中需要更多次的訓(xùn)練才能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)（圖1C,D），表現(xiàn)出行為靈活性障礙。此外，在延遲折扣行為范式中，SAMP8小鼠同樣表現(xiàn)出類似的癥狀（圖1F,G）。

眶額皮質(zhì)（orbitofrontal cortex, OFC）、杏仁核（amygdala）和后梨狀皮層（posterior piriform cortex, PPC）是基于氣味刺激的反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)的三個重要腦區(qū)，同時，伏隔核（nucleus accumbens, NAc）、OFC、內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex, mPFC）和杏仁核參與延遲折扣行為（圖1H）?；诖?，研究者借助c-fos和Egr1染色發(fā)現(xiàn)BLA神經(jīng)元活性降低，提示了BLA可能參與調(diào)節(jié)SAMP8小鼠的行為靈活性（圖1H-J）。此外，電生理記錄結(jié)果顯示，反轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)過程中，SAMP8小鼠BLA自發(fā)局部場電位（local field potential, LFP）中Theta 振蕩減弱（圖1K-P），提示了BLA神經(jīng)元活性降低，功能受損。

圖1 SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元活性降低，表現(xiàn)行為靈活性障礙

BLA神經(jīng)元程序性壞死參與衰老小鼠行為靈活性障礙
 

接下來，研究者借助Nissl染色和免疫組化發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元丟失以及突觸素（synaptophysin, SYP）表達(dá)降低（圖2A-C）。有趣的是，老年食蟹猴腦中也發(fā)現(xiàn)杏仁核神經(jīng)元丟失的現(xiàn)象（圖2D-F）。

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的兩種主要模式，研究者發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠和SAMR1小鼠（抗快速老化小鼠）的凋亡信號相關(guān)蛋白的表達(dá)無明顯差異，然而，程序性細(xì)胞壞死相關(guān)信號蛋白RIPK3，pRIPK3，MLKL和pMLKL的表達(dá)顯著增加（圖2G,H），且SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元pMLKL膜轉(zhuǎn)位明顯，提示細(xì)胞壞死（圖2I,J）。通過腹腔注射Nec-1s（選擇性壞死性凋亡抑制劑）后，發(fā)現(xiàn)可明顯改善SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元死亡及行為靈活性障礙（圖2M-P）。這些結(jié)果提示了程序性細(xì)胞壞死參與老年小鼠的神經(jīng)元死亡及行為靈活性障礙。
 

圖2 BLA神經(jīng)元程序性壞死參與老年小鼠行為靈活性障礙

GSK-3α調(diào)控mTORC1信號通路參與衰老小鼠行為靈活性障礙
 

基于上述結(jié)果，研究者進(jìn)一步研究介導(dǎo)老年小鼠BLA神經(jīng)元壞死的潛在分子機(jī)制。借助mRNA微陣列（mRNA microarrays） 發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠中存在8個基因顯著下調(diào)（圖3A），其中GSK-3α（糖原合酶激酶-3）是僅有一個被報道參與衰老和細(xì)胞死亡相關(guān)的基因，且在SAMPA8小鼠和老年食蟹猴杏仁核中GSK-3α表達(dá)水平明顯降低（圖3B-I），且BLA中GSK-3α的表達(dá)下調(diào)與pMLKL膜轉(zhuǎn)位高度相關(guān)（圖3J-N）。這些結(jié)果提示了GSK-3α的表達(dá)下調(diào)參與老年動物BLA神經(jīng)元壞死。

隨后，研究者驗證GSK-3α與神經(jīng)元壞死之間的因果關(guān)系，在GSK-3α^flox/+鼠BLA注射AAV2/8- hSyn-Cre病毒，條件性敲除小鼠BLA神經(jīng)元中GSK-3α基因（GSK-3α^+/−，圖3O-Q），結(jié)果顯示，GSK-3α^+/−小鼠BLA中RIPK3、pRIPK3、MLKL和pMLKL的表達(dá)水平顯著增加，同時表現(xiàn)出行為靈活性障礙（圖3R-Y）。這些結(jié)果提示了衰老小鼠BLA中GSK-3α表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和動物行為靈活性障礙。
 

圖3 下調(diào)BLA中GSK-3α的表達(dá)導(dǎo)致衰老小鼠神經(jīng)元壞死及行為靈活性障礙
 

進(jìn)一步，研究者在4月齡SAMP8小鼠BLA中注射AAV2/8-hSyn-GSK-3α病毒，發(fā)現(xiàn)BLA神經(jīng)元中過表達(dá)GSK-3α可導(dǎo)致SAMP8小鼠BLA中程序性細(xì)胞壞死相關(guān)信號蛋白表達(dá)水平顯著降低，并改善小鼠的行為靈活性障礙（圖4A-K）。研究者通過動物和細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GSK-3α表達(dá)可導(dǎo)致RIPK3蛋白水平及其磷酸化水平顯著增加（圖4L-N），提示了RIPK3降解受阻可能參與由GSK-3α表達(dá)下調(diào)誘發(fā)的神經(jīng)元壞死過程。

激活的mTOR信號通路可以通過抑制自噬來減少RIPK3的降解，研究者借助分子生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)，GSK-3α^+/−小鼠和老年SAMP8小鼠BLA中mTORC1信號通路被激活，自噬受損（圖4O-S），提示了mTORC1信號通路通過誘發(fā)自噬功能障礙參與老年小鼠神經(jīng)元壞死過程。
 

圖4 上調(diào)GSK-3α的表達(dá)改善了SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元程序性壞死及靈活性受損，mTORC1信號通路通過誘發(fā)自噬功能障礙參與老年小鼠神經(jīng)元壞死過程

獨(dú)居是老年行為靈活性障礙的高危因素
 

孤獨(dú)和社交孤立可加劇老年人或老齡動物的認(rèn)知改變，那么孤獨(dú)/社交孤立是否會影響老年動物的行為靈活性呢？為解答這一問題，研究者將3月齡SAMP8小鼠分為獨(dú)居（I-SAMP8）和群居（S-SAMP8）兩組，飼養(yǎng)1個月（圖5A），結(jié)果顯示，獨(dú)居SAMP8小鼠BLA神經(jīng)元中GSK-3α表達(dá)降低、mTORC1信號被激活、程序性細(xì)胞壞死相關(guān)信號蛋白表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失并表現(xiàn)出行為靈活性障礙（圖5B-M）。隨后，通過病毒載體過表達(dá)GSK-3α后可有效改善小鼠行為靈活性障礙（圖5N-R）。這些數(shù)據(jù)提示了獨(dú)居作為目前老年人中普遍存在的生活方式，是老年行為靈活性障礙的高危因素。
 

圖5 獨(dú)居是老年行為靈活性障礙的高危因素

結(jié)論
 

本文基于SAMP8快速衰老小鼠，配合行為學(xué)、病毒載體介導(dǎo)的基因調(diào)控手段、分子生物學(xué)等多種技術(shù)手段揭示老年行為靈活性障礙的潛在分子機(jī)制：BLA神經(jīng)元中GSK-3α的缺失誘發(fā)mTORC1信號通路的激活，從而促進(jìn)RIPK3依賴性細(xì)胞程序性壞死，導(dǎo)致BLA神經(jīng)元活性降低，引發(fā)行為靈活性障礙。同時研究還揭示了目前老年人中普遍存在的生活方式—獨(dú)居是老年行為靈活性障礙的高危因素，并提出了可能的干預(yù)策略。

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